張金寶，李曉娜，王桂琴

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

大腸埃希菌是澳大利亞醫(yī)學(xué)家Escherich在1885年借助顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)的。在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，一直被當(dāng)作是正常腸道菌群的組成部分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，學(xué)者們才逐漸認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸埃希菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，尤其對(duì)嬰兒和幼畜，常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥［1］。并引起患病畜禽生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，生產(chǎn)能力低下，甚至造成死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。大多數(shù)菌株具有運(yùn)動(dòng)性，屬于人和動(dòng)物體內(nèi)的共生菌，也是條件性致病菌，是重要的且數(shù)量最多的腸道菌群成員之一，主要寄居于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)［2］。致病性大腸埃希菌也是引起許多腸內(nèi)、腸外疾病的主要原因，并可以通過(guò)食物、水源等方式傳播，從而暴發(fā)疫情［3］。

目前，在養(yǎng)殖業(yè)中各種藥物的濫用導(dǎo)致病原微生物的耐藥性，已經(jīng)給疾病的防控帶來(lái)了新的嚴(yán)重的問(wèn)題，目前出現(xiàn)了一種細(xì)菌耐多種藥物的情況。如何減少細(xì)菌耐藥性，已經(jīng)成為世人關(guān)注的話題。著眼于目前的實(shí)際情況，新獸藥的研發(fā)和合理用藥是解決目前問(wèn)題的關(guān)鍵。截止目前，人們也只是了解部分大腸埃希菌毒力基因，加之近些年大腸埃希菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)及不同血清型的菌株毒力之間也有差別，使得毒力基因和耐藥性之間的研究尤為重要。因此，了解大腸埃希菌毒力基因、耐藥性及其它們之間的關(guān)系是解決致病性大腸埃希菌感染問(wèn)題的關(guān)鍵因素之一。

1 大腸埃希菌毒力基因

大腸埃希菌是人和動(dòng)物體內(nèi)的共生菌，也是條件性致病菌，甚至威脅到宿主機(jī)體生命健康。目前，致病性大腸埃希菌的毒力因子主要分為黏附素和毒素。最初致病性大腸埃希菌是根據(jù)其臨床癥狀而命名的，例如致瀉性大腸埃希菌、致腎盂腎炎大腸埃希菌、致新生兒腦膜炎大腸埃希菌 、敗血性大腸埃希菌等。后來(lái)根據(jù)血清型將其分為K、O、H抗原型大腸埃希菌。

如今，根據(jù)致病性大腸埃希菌的致病特性將其分為3個(gè)主要亞群，即共棲菌或非致病性大腸埃希菌、引起腸道感染的致病性大腸埃希菌和腸外致病性大腸埃希菌（Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC）。腸道致病性大腸埃希菌亞群涉及多種病型如腸致病性大腸埃希菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli，STEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）、腸出血性大腸埃希菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）、侵襲性大腸埃希菌（Enteroinvasive invasive E.coli，EIEC）等［4］。

在EPEC中具有一個(gè)腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)（locus of enterocyte effacement，LEE）毒力島，其含有seps、escs、ces、ler、Tir、eaeA、EspA、EspB、EspD等基因；EHEC包含有Stx、Stx1、Stx2、Stx2c、Stx2d、Stx2e、hlyA、hlyE、hlyF等；EAEC毒力基因和致病因子有aggR、aggA、aafA、astA、agg3、aatA、pet、aap 等；ETEC包含的基因有ST（STa、STb）、LT等。論文主要介紹eaeA、Stx2e、ST（STa、STb）和astA 4個(gè)毒力基因。

1.1 eaeA基因

腸致病性大腸埃希菌（EPEC）菌株的毒力基因島和小基因簇容易引起急性胃腸炎。在發(fā)展中國(guó)家，EPEC是引起嬰兒腹瀉的顯著原因，這與它的高病死率（10%～40%）相關(guān)聯(lián)［5］。

在EPEC中具有一個(gè)腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)（LEE）毒力島。LEE是細(xì)菌染色體上編碼毒力相關(guān)基因，大小為35kb的特殊區(qū)域［6］，G＋C%含量為38.36%，這比大腸埃希菌全基因組G＋C%含量50.8%要低得多，它所編碼的毒力因子是引起腸黏膜黏附與脫落損傷所必需的。所含有的基因主要有sep、esp和eaeA基因。最初被發(fā)現(xiàn)的基因是eaeA基因，一種分子量為94ku～97ku稱(chēng)為緊密黏附素的細(xì)菌外膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌緊密黏附在宿主腸上皮細(xì)胞上。eaeA基因位于LEE致病島上的第22個(gè)開(kāi)放性閱讀框，即ORF22。LEE毒力島中的eaeA基因編碼eaeA基因的5′端及中間區(qū)域約2/3在不同細(xì)菌和不同菌株間高度保守，而3′端變異較大。

1990年，Jerse最先用TnphoA突變體的方法克隆鑒定并報(bào)道了eaeA基因。所有導(dǎo)致黏附脫落（attaching and effacing，A/E）損傷的豬源大腸埃希菌都有LEE毒力島 。在一些研究中表明eaeA陽(yáng)性的非典型腸道致病性大腸埃希菌菌株是最常見(jiàn)的，占到73%。還有試驗(yàn)證明在非典型腸道致病性大腸埃希菌菌株中eaeA陽(yáng)性率大于典型腸道致病性大腸埃希菌菌株［7］。引起 A/E損傷的所有基因都位于大腸埃希菌基因組被稱(chēng)為腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)（LEE），這些基因主要包括編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)（esc或sep），分泌型蛋白質(zhì)（esp）及其分子伴侶；緊密素易位受體（tir）和外膜蛋白緊密素（eaeA）等基因，最主要的一個(gè)基因就是eaeA基因［8］。LEE在豬源大腸埃希菌中的存在是某些豬場(chǎng)引起仔豬腹瀉的原因之一。

1.2 Stx2e基因

腸出血性大腸埃希菌（EHEC）通常通過(guò)進(jìn)食生的或未熟的肉類(lèi)、生牛奶或者生食被污染的蔬菜水果而發(fā)病，其主要通過(guò)黏附素在消化道定殖，產(chǎn)生志賀樣毒素（Shiga toxin，Stx）。志賀毒素基因是一個(gè)新興的致病基因，可引起人的出血性結(jié)腸炎-溶血性尿毒綜合征（Hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome，HUS）、腹瀉和豬水腫病的重要致病因子［9］。

Stx基因又名Vero細(xì)胞毒素（Vero toxin，VT），是由A、B兩個(gè)亞單位組成的A-5B模式的復(fù)合毒素。A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性，能與28S rRNA作用從而抑制蛋白質(zhì)的合成，是EHEC引起臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)；B亞單位是無(wú)毒的，具有細(xì)胞結(jié)合特性，能與具有特定糖鞘脂受體（Gb3）的細(xì)胞結(jié)合，而引起A亞單位發(fā)揮作用。志賀樣毒素是一種決定EHEC特性的最為重要的毒力因子，主要血清型是O157∶H7。感染后出現(xiàn)感染性腹瀉、出血性結(jié)腸炎，還可在5%～10%的病例中引起溶血性尿毒綜合征及血栓性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可引起死亡［10］。其按照抗原性和免疫原性的不同，分為Stx1和Stx2，分別編碼1型與2型志賀毒素且抑制哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)合成［11-13］。Stx2的突變體有Stx2c、Stx2d、Stx2e和Stx2f等至少12種變種類(lèi)型［14］，其中產(chǎn)志賀樣毒素大腸埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）為豬水腫病的病原，而STEC產(chǎn)生的Ⅱ型志賀毒素變異體e亞型（Shiga toxin 2e，Stx2e）是重要的致病因子，又叫豬水腫病毒素，與Stx2基因序列的同源性在90%左右［15-16］。來(lái)自人和牛的Stx2主要與Gb3受體結(jié)合，B亞基的64、66位氨基酸與Gb3、Gb4的結(jié)合力有關(guān)。大腸埃希菌O157：H7可產(chǎn)生Stx1和Stx2兩種類(lèi)型的毒素，均與Vero細(xì)胞表面Gb3受體結(jié)合［17］。因此，O157：H7產(chǎn)生的Stx毒素對(duì)Vero細(xì)胞存在很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

Stx2e毒素所引起的人類(lèi)疾病不斷被報(bào)道，據(jù)統(tǒng)計(jì)從患病人體內(nèi)已經(jīng)分離到了472種血清型的STEC。在眾多產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌中，最為人們熟知的是大腸埃希菌O157：H7，而其他較不常見(jiàn)的致病菌株，亦可引起嚴(yán)重疾病。2011年5月，在德國(guó)一個(gè)較為罕見(jiàn)的產(chǎn)志賀毒素的血清型（O104：H4）引起腹瀉和溶血性尿毒癥的暴發(fā)，疫情造成數(shù)千人感染，至少34人死亡［18］。Oanh T K N 等［19］報(bào)道用Stx2e毒素A亞基的雙突變株（Y77S，E167Q）無(wú)論是直接免疫仔豬還是預(yù)先免疫母豬都能對(duì)ED起到很好預(yù)防作用。

在有些情況下，禁止使用某種化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致其他化學(xué)物質(zhì)使用量激增，破壞減排計(jì)劃。例如，法國(guó)的小麥種植者依靠包裹在種子上的新煙堿類(lèi)物質(zhì)來(lái)保護(hù)植株不受蚜蟲(chóng)和葉蟬的侵害，現(xiàn)在這類(lèi)殺蟲(chóng)劑被禁用，一些種植者可能會(huì)增加其他殺蟲(chóng)劑的使用。另外還有其他的利弊權(quán)衡，一些專(zhuān)家擔(dān)心，禁用除草劑草甘膦，農(nóng)民就得在土壤中除草，可能會(huì)導(dǎo)致水土流失或增加溫室氣體排放。芬格認(rèn)為，“迫切需要”對(duì)這種利害關(guān)系權(quán)衡進(jìn)行更多的研究。

1.3 ST 基因

產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）是引起幼畜禽腹瀉甚至死亡的主要病原菌。據(jù)估計(jì)，因ETEC引起的新生幼畜腹瀉發(fā)病率高達(dá)30%～50%，病死率達(dá)10%～30%。國(guó)內(nèi)約有35%的仔豬腹瀉是由ETEC引起的，而在美國(guó)等國(guó)家，由ETEC引起的新生仔豬腹瀉占45%以上，給畜牧業(yè)造成巨大損失［20］，最早流行于20世紀(jì)60年代晚期。其具有兩類(lèi)致病因子，一類(lèi)為黏附素（或稱(chēng)定植因子），另一類(lèi)為腸毒素。ETEC產(chǎn)生兩種腸毒素，一種為耐熱性腸毒素（heat stable toxin，ST），在100℃30min基本不失活；另一種為不耐熱性腸毒素（LT），在65℃30min即完全失活。ST分子質(zhì)量較低（＜9ku），無(wú)抗原性，成熟的ST為18或19個(gè)氨基酸組成的小肽，有很強(qiáng)的毒素活性，而免疫原性極差。根據(jù)ST的生物學(xué)特性及致病性，將其分為STa和STb兩類(lèi)。

STa是一種小分子質(zhì)量蛋白（約2ku），由18個(gè)氨基酸（STap，豬源或人源）或19個(gè)氨基酸（STah，人源）構(gòu)成，具有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵［21］。其含有13個(gè)高度保守的氨基酸序列（5～17氨基酸），這段氨基酸小肽保留了STa的完全毒性，為一個(gè)毒性區(qū)，它具有與天然毒素相似的受體蛋白結(jié)合能力。可溶于甲醇，可引起乳鼠和乳豬腸積水。STa在導(dǎo)致腹瀉的ETEC分離株中的檢出率很高，STa的陽(yáng)性率為75%，STb的檢出率約為90%；在流行病學(xué)上起著重要作用，兩者都激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，擾亂電介質(zhì)代謝，引起腹瀉［22］。

STb發(fā)現(xiàn)的相對(duì)較晚，因此關(guān)于它的研究相對(duì)滯后于STa。一些研究者發(fā)現(xiàn)在引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC分離株中，STb的檢出率非常高，與斷奶仔豬腹瀉密切相關(guān)，因而引起研究者的廣泛關(guān)注。STb是一種由48個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為5ku，多肽分子的前體為71個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量8.1ku；成熟STb分子含有4個(gè)半朧氨酸（cys）殘基，可以形成2個(gè)分子內(nèi)的二硫鍵［21］，分別位于cys-10和cys-48之間以及Cys-21和Cys-36之間。STb不溶于甲醇，對(duì)乳鼠不引起腸積水，而對(duì)斷乳小豬可致腸積水。

目前，全世界人類(lèi)疾病預(yù)防方面使用ETEC疫苗中都沒(méi)有包括ST成分，在我國(guó)動(dòng)物疾病預(yù)防方面用ETEC疫苗中也很少見(jiàn)有使用STa或STb的報(bào)道。對(duì)于這種狀況，國(guó)內(nèi)外研究者為了獲得STa與STb的類(lèi)毒素，將其兩者與多種蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)或用基因工程手段構(gòu)建融合蛋白—“ST-載體”。

1.4 astA基因

腸聚集性大腸埃希菌（Enteroaggregative E.coli，EAEC）是嬰幼兒及幼畜禽持續(xù)性腹瀉的病原。于1987年，在智利的一位患持續(xù)性腹瀉的兒童糞便中分離得到，該菌在組織培養(yǎng)中以特有的“磚塊樣”或“聚集樣”的形式黏附在上皮細(xì)胞株 HEp-2上，被命名為腸聚集性大腸埃希菌（EAEC或EaggEC）［23］。其對(duì)動(dòng)物及人的腸黏膜能發(fā)生特征性黏附，對(duì)人小腸下段及結(jié)腸黏膜的黏附最強(qiáng)，對(duì)人、牛等紅細(xì)胞發(fā)生抗D-甘露糖的血凝。經(jīng)研究調(diào)查顯示，發(fā)達(dá)國(guó)家EAEC感染引起腹瀉約為4%，而在發(fā)展中國(guó)家EAEC感染引起腹瀉的發(fā)病率達(dá)到15%。

近年研究的EAEC毒力基因和致病因子有aggR、aggA、aafA、astA 等［24］。EAEC 毒 素 基 因 有3種，即質(zhì)粒編碼毒素（pet）、EAEC耐熱腸毒素（EAST1）、志賀菌腸毒素（SHET1）。其中腸毒素astA基因是編碼腸聚集性耐熱毒素，與大腸埃希菌Sta腸毒素基因有類(lèi)似的性質(zhì)。astA是耐熱蛋白，與ETEC產(chǎn)生的腸凝集性大腸埃希菌耐熱腸毒素Ⅰ（EAST1）功能相同。最初這種毒素只是從EAEC菌株中檢出，隨后在 ETEC、EHEC、EPEC 和DAEC的菌株中均檢測(cè)出了astA基因，基因在健康豬和疾病豬中均有發(fā)現(xiàn)，但是一旦與其他毒力基因如sta及F菌毛等同時(shí)存在于豬體內(nèi)時(shí)，便能導(dǎo)致豬腹瀉。

2 大腸埃希菌毒力基因與耐藥性

至今，有關(guān)大腸埃希菌毒力基因和耐藥性之間相關(guān)性研究相對(duì)少見(jiàn)。國(guó)內(nèi)外研究表明，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體及整合子基因盒等，這些可塑性的遺傳因子使細(xì)菌基因具有可變性，其也是造成耐藥性廣泛傳播的重要原因，揭示了獲得外源性毒力基因的可能性。因此，如果毒力基因和耐藥性基因位于相同的可移動(dòng)元件上，則在抗生素的選擇壓力下，會(huì)引起共轉(zhuǎn)移，造成毒力和耐藥性的同時(shí)增強(qiáng)［25］。

國(guó)外一些學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了大腸埃希菌毒力基因和耐藥性之間的聯(lián)系，認(rèn)為耐藥基因和毒力基因間有分子聯(lián)系。Petkovsek Z等［26］對(duì)皮膚軟組織分離的人源大腸埃希菌中耐藥和毒力基因間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥菌株擁有的毒力基因顯著低于敏感株，而阿莫西林耐藥株和敏感株擁有的毒力基因沒(méi)有顯著性的差異。Akua A S等［27］研究結(jié)果顯示禽類(lèi)的腸外致病性大腸埃希菌（ExPEC）毒力因子能夠加強(qiáng)這些菌株在腸外的致病性，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與耐藥基因或者毒力基因之間有相關(guān)性。

3 小結(jié)

隨著動(dòng)物疾病種類(lèi)的增多，導(dǎo)致疾病預(yù)防中藥物的使用以及養(yǎng)殖業(yè)中的飼料添加劑急劇增加，使病原微生物出現(xiàn)耐藥性，特別是多重耐藥性菌株在動(dòng)物機(jī)體中的出現(xiàn)。在這種嚴(yán)峻的形式下，如何預(yù)防和控制動(dòng)物疾病是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。如今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均認(rèn)為大腸埃希菌較易產(chǎn)生耐藥性而且變化快，隨時(shí)間的推移大腸埃希菌的耐藥率逐漸上升，多重耐藥菌株迅速增多以及耐藥譜擴(kuò)增。大腸埃希菌為適應(yīng)各種新環(huán)境，其毒力基因通過(guò)各種不同的機(jī)制引起動(dòng)物機(jī)體腸道、泌尿道等各器官的疾病。大腸埃希菌毒力基因不僅存在于細(xì)菌染色體中，還存在于質(zhì)粒、噬菌體等中，通過(guò)侵襲機(jī)體組織引起發(fā)病，它所編碼的毒素、黏附因子及定植因子等毒力因子相互協(xié)調(diào)起作用。詳細(xì)了解大腸埃希菌毒力基因可以確定大腸埃希菌的病原型別，對(duì)確定動(dòng)物疾病的傳染源以及提供流行病相關(guān)性證據(jù)起重要作用，對(duì)保證食品安全、疾病的流行病學(xué)調(diào)查及防控具有重要意義。

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