孫慧燕 楊曉明 王立生

microRNAs(miRNAs)是大小為19 ～25bp 的非編碼小RNA，其可以在轉(zhuǎn)錄后和(或)轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)［1，2］。Hsa-miR-486 -5p 是由鄭曉飛教授課題組于2005 年利用人胎肝組織研究microRNA 鑒定方法時首先鑒定并注冊的5 種新microRNAs(miR-483 ～miR -487)之一［3］。目前，關(guān)于miR -486 的表達(dá)及生物學(xué)功能的文獻(xiàn)報道非常有限。2010 年，由Olson 所指導(dǎo)課題組在Proc Natl Acad Sci上闡明miR -486 在肌肉高表達(dá)，并可能是PI3K/AKT 的調(diào)控基因，預(yù)言miR -486 在肌肉萎縮的病理生理過程中起重要作用［4］。2011 年，由Kunke 所指導(dǎo)課題組在《Skeletal Muscle》雜志上進(jìn)一步闡明miR-486 在杜興肌肉營養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy，DMD)的病理過程中起到重要調(diào)控作用［5］。在這兩篇文章中都提到miR -486 的宿主基因為ANK1，而后者屬于錨蛋白家族，與細(xì)胞骨架運動密切相關(guān)。Kim 等［6］認(rèn)為，miR -486 -5p 是SIRT1 的內(nèi)源性抑制劑，能誘導(dǎo)人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue - derived mesenchymal stem cells，hAT - MSCs)復(fù)制性衰老，而SIRT1 被證實是miR-486 -5p 的靶基因。有研究者認(rèn)為，miR -486在胃癌中是一新的抑癌miRNA，其靶基因為抗凋亡基因OLFM4［7］。PNAS 提到miR-486 在肺癌中表達(dá)降低，其靶基因為胰島素生長因子信號途徑中的IGF1、IGF1R 及PIK3R1 等，miR -486 很可能是肺癌的一個新的抑癌基因［8］。目前，對miR -486 的認(rèn)識還很不清楚，甚至在不同的組織其作用是相反的。因此，有必要借助生物信息學(xué)的一些預(yù)測軟件結(jié)合筆者的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以利于得出更客觀的結(jié)論。TargetScan 是由MIT 提供的在線對microRNAs 進(jìn)行靶基因預(yù)測的軟件之一，其能鏈接microRNA 相應(yīng)靶基因的研究數(shù)據(jù)，并能提供靶基因3'UTRs 相關(guān)信息。在筆者的實驗過程中，發(fā)現(xiàn)miR -486 對癌細(xì)胞的遷移、增殖和細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了影響。因此，利用TargetScan 5.2 軟件對其促癌及細(xì)胞骨架相關(guān)靶基因進(jìn)行了預(yù)測研究，以期對miR -486 的進(jìn)一步研究起到指導(dǎo)作用。

TargetScan 預(yù)測hsa-miR-486 -5p 有106 個保守靶基因，共有109 個保守位點，22 個保守性不好的位點。106 個保守靶基因中與促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的有16 個，與細(xì)胞骨架有關(guān)的有9 個，當(dāng)然它們也會有交叉，比如CLDN10 和CIT 與細(xì)胞骨架有關(guān)，同時也是很多腫瘤的促癌基因。除了這類基因外，筆者也發(fā)現(xiàn)了一些與之無關(guān)或相反的靶基因，在本文中沒有敘述，因為它們可能會在其他的生理或病理生理過程中起作用。隨著預(yù)測手段的進(jìn)步，這些數(shù)字還會發(fā)生改變。但本文主要是想提供一種思路和參考。

一、促癌相關(guān)靶基因

以下排序依據(jù)網(wǎng)站提供順序，與功能大小無關(guān)。

1. PLAGL2:PLAGL2(pleiomorphic adenoma gene like 2，PLAGL2)是一類來源于PLAG 基因家族(PLAG1，PLAGL1 和PLAGL2)的鋅指蛋白，其基因位于染色體20q11.1，是一種急性髓系白血病的促癌基因［9，10］。這可以提示miR-486 可能會與血液系統(tǒng)疾病有關(guān)。

2.ARID4B:ARID4B(AT -rich interactive domain-containing protein 4B)蛋白由ARID4B 基因編碼的蛋白質(zhì)。ARID4B 是組蛋白去乙酰酶依賴的SIN3A轉(zhuǎn)錄輔助抑制復(fù)合體的組成部分，其參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤發(fā)生等。從一位乳腺癌患者分離出此基因的IgG 抗體。在ARID4B 上鑒定出一新的乳腺癌抗原表位SSKKQKRSHK，其表達(dá)和乳腺癌的進(jìn)程有關(guān)，因此血清中抗體的水平可能對乳腺癌的診斷有幫助［11］。

3.AFF3:AFF3(AF4/FMR2 family member 3)核轉(zhuǎn)錄因子在淋巴發(fā)展和腫瘤發(fā)生中有重要作用。在一些ALL 患者，此基因和MLL 有融合現(xiàn)象［12］。

4.SFRS3:也被稱為SRp20。Zheng 等發(fā)現(xiàn)splicing factor SRp20 (SFRS3)在癌中高表達(dá)，其調(diào)控Forkhead box transcription factor M1 (FoxM1)和后者靶基因PLK1 和Cdc25B 的表達(dá)，影響細(xì)胞周期和增殖。小RNA 干擾SRp20 的表達(dá)，引起G2/M 阻滯，生長延緩和凋亡。在成纖維細(xì)胞過表達(dá)SRp20 引起細(xì)胞過度增殖和轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)能誘導(dǎo)成瘤。因此，SRp20 在腫瘤細(xì)胞過表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和維持的重要步驟［13］。

5. OLFM4:OLFM4 是olfactomedin domain - containing 蛋白家族成員，其在胃腸道(胃、小腸、大腸)、前列腺和骨髓表達(dá)較高。最近研究認(rèn)為OLFM4 參與到一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，尤其是胃腸道腫瘤。OLFM4 對腫瘤細(xì)胞有抗凋亡和促增殖作用，并且與腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移都有關(guān)系［14，15］。另有實驗證實OLFM4 作為miR-486 的靶基因在胃癌中起重要作用［16］。OLFM4 除了在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用外，Chen 等發(fā)現(xiàn)其可參與宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌的分化。因此OLFM4 也有可能在女性生殖道腫瘤中扮演重要角色［17］。

6.EphA3:EphA3 屬于Eph/ephrin 酪氨酸激酶系統(tǒng)的組成成分之一，后者在細(xì)胞增殖與活力、細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移和抗細(xì)胞凋亡中起重要作用。Eph 受體酪氨酸激酶家族可以控制多種細(xì)胞生物學(xué)過程:細(xì)胞黏附和運動、細(xì)胞塑形和細(xì)胞生長。EphA3 是癌中最多的Eph 受體突變體，其與癌癥的關(guān)系很復(fù)雜［18］。EphA3 和CD133 在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并且其與腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM分期正相關(guān)。高表達(dá)EphA3 和CD133 的結(jié)直腸癌患者其生存期較短。EphA3 和CD133 可以作為結(jié)直腸癌的臨床評價指標(biāo)［19］。

7.Sp5:Sp5 屬于SP 鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，其編碼C2H2 鋅指蛋白，C 末端有DNA 結(jié)合域。Sp5 在多種腫瘤(HCC、胃癌、腸癌)中高表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 不表達(dá)內(nèi)源性Sp5，將Sp5 轉(zhuǎn)移入MCF -7細(xì)胞后，能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。

8.PIK3R1:PIK3R1(phosphatidylinositol 3 -kinase regulatory subunit alpha)是胰島素生長因子信號途徑中一種重要的酶。利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA 策略敲減此基因在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)細(xì)胞的表達(dá)，可以抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。敲減PIK3CA 或PIK3R1 可降低FAK 活性，敲減PIK3R1 可降低MMP2 表達(dá)，推測PIK3R1 像PIK3CA 一樣可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，是GBM 的一個潛在治療靶點。而Croce 等的研究結(jié)果認(rèn)為，不僅PIK3R1 是miR -486 在肺癌中的靶基因，其他相關(guān)分子IGF1、IGF1R 也作為miR-486 在肺癌中的靶基因發(fā)揮重要作用［8］。

9. PIM1:PIM1(proto - oncogene serine/threonine-protein kinase Pim-1)為絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，PIM 亞家族。主要在B 淋巴和髓系細(xì)胞系表達(dá)，在血液系統(tǒng)腫瘤和前列腺癌高表達(dá)?？纱龠M(jìn)細(xì)胞細(xì)胞增殖和存活。Pim -1 的特異性單抗p9 明顯抑制細(xì)胞增殖。

10.C1orf21:C1orf21(chromosome 1 open reading frame 21)基因與胃癌有關(guān)。

11.SMOC1:SMOC1(SPARC-related modular calcium-binding protein 1)在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤高表達(dá)。實驗證實在體外SMOC1 可以與tenascin -C 相互作用。在U87 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SMOC1 可以影響其遷移。

12.CXCR5:CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，在Burkitt's 淋巴瘤中高表達(dá)，其在B 細(xì)胞的遷移中起重要作用。趨化因子和其受體參與前列腺癌(prostate cancer，PCa)的轉(zhuǎn)移。CXCR5 在PCa 明顯高表達(dá)。在PCa 細(xì)胞侵襲和遷移中具有重要作用。

13.Gab2:Gab2(GRB2 -associated -binding protein 2)是激活磷脂酰肌醇3 (phosphatidylinositol 3 -kinase，PI3K)的適配體蛋白。其在乳腺癌和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中高表達(dá)，是一原癌基因蛋白。除此，Gab2 在肺癌中也高表達(dá)，提示其在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中也起到一定的作用。Docking 蛋白在多種腫瘤中高表達(dá)，并且與轉(zhuǎn)移特性有密切關(guān)系。Gab2 在乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 高表達(dá)后可阻滯細(xì)胞伸展，減弱應(yīng)力纖維和成熟黏著斑，促進(jìn)細(xì)胞遷移。

14.BZW1:黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是唾液腺最普遍的一種惡性腫瘤。Situ等證實BZW1(basic leucine zipper and W2 domain -containing protein 1)在MEC 生長中具有重要作用。利用qPCR 和免疫組化證實BZW1 在MEC 組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而且與病情分級有關(guān)。利用特異RNA干擾慢病毒抑制BZW1 表達(dá)則抑制Mc3 細(xì)胞增殖和克隆形成，并且使細(xì)胞停留在G0/G1期。抑制細(xì)胞遷移和侵襲，在體內(nèi)實驗中也得到了相同的結(jié)果。

15.SFRS1:SFRS1 也稱為SF2/ASF，被認(rèn)為是一種原癌蛋白。利用免疫組化方法在81 例非小細(xì)胞肺癌(non -small cell lung cancer，NSCLC)患者的癌組織中檢測SF2/ASF 的表達(dá)，結(jié)果顯示大部分原發(fā)性NSCLC 腫瘤組織中SF2/ASF 都高表達(dá)。體外實驗中，小RNA 干擾SF2/ASF 促進(jìn)了NSCLC 細(xì)胞系的凋亡，其機(jī)制與survivin- mTORC1 - 4E-BP1 有關(guān)。

16.SRF:SRF 調(diào)控立早基因的轉(zhuǎn)錄，引起多種細(xì)胞增殖、遷移和分化?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。利用Western blot 法檢測SRF 和MMP -2 and MMP-9 在HCC 組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對比癌旁組織這3 種基因明顯升高。高表達(dá)SRF 的組織中MMP-2 and MMP-9 的表達(dá)也增高。在HLE 細(xì)胞中過表達(dá)SRF 后，MMP -2 和MMP -9 的表達(dá)和酶活性均增加，且細(xì)胞遷移能力增加。

二、細(xì)胞骨架相關(guān)靶基因

1. SLC10A7:SLC10A7［solute carrier family 10(sodium/bile acid cotransporter family)，member 7］屬于SLC10 家族成員，但不同于其他成員，其有10 個穿膜結(jié)構(gòu)域。SLC10A7 相關(guān)蛋白不僅存在于脊椎動物，還存在于酵母、植物甚至細(xì)菌。因此，SLC10A7 為分布最廣泛的載體家族成員。

2.COL6A6:COL6A6(collagen，type Ⅵ，alpha 6)膠原蛋白Ⅵ是調(diào)控上皮細(xì)胞-纖連蛋白的重要基膜成分，是一種細(xì)胞結(jié)合蛋白。

3. TWF1:TWF1 編碼一種肌動蛋白結(jié)合蛋白twinfilin，非常保守。定位于cortical G - actin - rich structures，受小GTPase RAC1 調(diào)控。它同時作為microRNA-1 的靶基因在心肌肥大的病理生理學(xué)過程中起重要作用。

4. CLDN10:此基因編碼claudin 家族中一員。claudin 家族是integral 膜蛋白，參與組成緊密連接。CLDN10 與HCC 的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，CLDN10 在肺癌中也普遍表達(dá)。CLDN10 在HCC 高表達(dá)，而且與血管生成緊密相關(guān)，其可作為HCC 術(shù)后不良預(yù)后的有用指標(biāo)。CLDN10 在HCC 的侵襲中起重要作用，可作為HCC 治療的潛在靶點。Han 等發(fā)現(xiàn)CLDN10 可以作為雞卵巢癌的新生標(biāo)志物，由于以雞作為合適的動物模型，因此這對人類卵巢癌的預(yù)測也具有一定的意義。

5.ARHGAP5:ARHGAP5(Rho GTPase -activating protein 5)編碼p190 -B RhoGAP，后者負(fù)調(diào)控RhoA活性從而促進(jìn)HuH-7 肝癌細(xì)胞伸展和遷移。

6. CIT:CITRON (rho - interacting，serine/threonine kinase 21)，簡稱CIT，此基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞中間體的重要成分，在細(xì)胞分裂中起重要作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。CITRON 在HCC 癌組織中高表達(dá)，在SMMC -7721 細(xì)胞中用腺病毒介導(dǎo)的方式敲除CITRON，抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成。在裸鼠荷瘤實驗中發(fā)現(xiàn)敲減CITRON 可以抑制腫瘤的形成。

7. RICH2:RICH2，又被稱為ARHGAP44(Rho GTPase activating protein 44)。敲減CD317 或RICH2會產(chǎn)生同樣的表型:頂端肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的消失，伴隨頂端微絨毛的消失。同時，基底面肌動蛋白束增加;細(xì)胞高度縮減而緊密連接沒有任何改變。抑制上皮轉(zhuǎn)化和頂端及基膜蛋白的極化。

8.MKL1:巨核細(xì)胞白血病蛋白1(megakaryoblastic leukemia protein -1，MKL1)，也稱MAL、MRTF -A、BSAC，屬于MRTF 轉(zhuǎn)錄因子家族，后者有共同的肌動蛋白結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域等。MKL1 調(diào)控多種過程:肌細(xì)胞分化、心血管發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、巨核細(xì)胞分化和遷移、細(xì)胞運動和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。MKL1 在腫瘤方面起到雙重作用:腫瘤促進(jìn)和腫瘤抑制。有實驗證實，MRTF-A 在肺纖維化的膠原合成中起重要調(diào)控作用，而這依賴于SRF 和Sp1 對膠原表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

9.MYLK2:此基因編碼肌球蛋白輕鏈激酶，廣泛分布于成人骨骼肌中。在腫瘤中MYLK2 激酶域很少發(fā)生突變，在腫瘤發(fā)生中不扮演重要角色。

綜上所述，microRNAs 的功能研究離不開其靶基因的預(yù)測。目前，應(yīng)用于靶基因預(yù)測的數(shù)據(jù)庫有miRbase、starBase、Tarbase、miRecords、targetScan、Pic-Tar、miRanda 和microRNA.org 等。Targetscan 是基于靶mRNA 序列的進(jìn)化保守等特征搜尋動物的microRNA 靶基因的軟件，其預(yù)測microRNA 靶標(biāo)假陽性率較低。筆者利用此網(wǎng)站，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了有效的靶基因預(yù)測分選，為課題的順利進(jìn)行打下了良好的基礎(chǔ)。

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