初志戰(zhàn)，巫光宏，劉小林

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2江西宜春學(xué)院，江西宜春 336000）

玉米蛋白粉（CGM），俗稱玉米渣，是玉米濕法生產(chǎn)淀粉過程中的主要副產(chǎn)品.玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)高達(dá)40% ～70%，其中醇溶蛋白約占總蛋白的68%，谷蛋白約占28%，同時含有少量的球蛋白和白蛋白.由于玉米醇溶蛋白中含有大量的非極性氨基酸，因此在體積分?jǐn)?shù)為60%～95%的醇類水溶液中溶解度較高，而在水溶液中溶解性很差.在我國，玉米蛋白粉作為生產(chǎn)淀粉的下腳料，大部分作為“工業(yè)三廢”排放掉了，不僅沒有實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用，還造成了嚴(yán)重浪費(fèi)和環(huán)境污染，經(jīng)濟(jì)效益極低.近年來隨著對玉米醇溶蛋白研究的不斷深入，玉米醇溶蛋白組成的特殊性逐漸引起人們的重視，不斷開發(fā)出新的產(chǎn)品，例如利用玉米醇溶蛋白制作保鮮膜、緩釋膠囊、可降解塑料等環(huán)境友好材料.如何利用醇溶蛋白的營養(yǎng)價值，成為進(jìn)一步提高醇溶蛋白開發(fā)的核心.研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白中支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）含量相當(dāng)高，可用于制取高F值（支鏈氨基酸對芳香族氨基酸的摩爾比稱為F值）寡肽分子，以改善肝、腎、腸、胃疾病患者的營養(yǎng)，可用于功能性食品或醫(yī)藥產(chǎn)品中.欒新紅等［1］發(fā)現(xiàn)玉米蛋白多肽能影響鵝肉品質(zhì)及機(jī)體代謝.玉米蛋白含有高比例纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺等，而賴氨酸等堿性氨基酸很少，這種不平衡氨基酸組成可以抑制人體中的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE），使玉米醇溶蛋白成為降血壓肽很好的來源.

目前，對玉米醇溶蛋白開發(fā)和研究較為成熟的是日本和美國.日本用玉米多肽開發(fā)出了低熱量的早餐飲料.我國酶解制備玉米多肽的研究起步較晚，最早的研究記錄在20世紀(jì)90年代末.1998年，吳建平［2］用復(fù)合酶（堿性蛋白酶+胃蛋白酶）對玉米蛋白進(jìn)行水解，獲得了相對分子質(zhì)量較小、有明顯抑制ACE活性的玉米多肽.王雄等［3］用堿性蛋白酶處理玉米黃粉，獲得多肽.1999年王梅等［4］用3種堿性蛋白酶、2種中性蛋白酶、3種酸性蛋白酶對蛋白進(jìn)行水解比較研究，指出用堿性蛋白酶水解得到的蛋白水解物其溶解性好，營養(yǎng)價值高.2000年趙國華等［5］用AS1398酶處理玉米蛋白，得到流動性好、黏度低、熱穩(wěn)定性較好、乳化性好的玉米多肽分子.但由于玉米醇溶蛋白的純水不溶性與蛋白酶必需的水溶液環(huán)境相沖突，使得玉米醇溶蛋白酶解程度較低，達(dá)不到可以應(yīng)用的程度，這已成為玉米多肽開發(fā)的瓶頸.本研究根據(jù)醇溶蛋白可溶于高pH緩沖液這一特點(diǎn)，將提取的醇溶蛋白液加入pH＞11.5的緩沖液中，然后篩選在堿性條件中仍保持較高活性的酶——堿性蛋白酶和蛋白酶K，比較醇溶蛋白的降解程度，為玉米多肽產(chǎn)品的開發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

玉米蛋白粉由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院提供.

蛋白酶K和堿性蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 試驗(yàn)方法

稱取一定量玉米蛋白粉，放入烘箱中80℃烘6 h，粉碎后過100目篩，利用有機(jī)溶劑法［6-7］提取得到玉米醇溶蛋白，然后用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定提取液中玉米醇溶蛋白的含量.

醇溶蛋白的水解先采用堿性蛋白酶和蛋白酶K分別對玉米醇溶蛋白進(jìn)行水解，確定每種酶的最佳作用條件，然后再選用兩步酶法水解.水解度的測定采用 pH-stat法［8-9］和 SN-TCA指數(shù)法［10］.采用袁斌等［11］改進(jìn)的pH-stat法初步測定醇溶蛋白各種加酶方式的水解度，然后與SN-TCA指數(shù)法測定的水解度進(jìn)行比較，確定最適的加酶方式.

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇法提取醇溶蛋白參數(shù)的選擇

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對玉米醇溶蛋白提取效果的影響 玉米醇溶蛋白能夠溶解在體積分?jǐn)?shù)為60%～95%的乙醇溶液中，本試驗(yàn)對比了體積分?jǐn)?shù)為65%、75%、85%和95%的乙醇對提取效果的影響，結(jié)果表明，用65%～85%的乙醇作為溶劑時，蛋白的提取率都大大高于用95%乙醇作為溶劑時的提取率，而用75%乙醇作為溶劑的提取率最高.故選擇體積分?jǐn)?shù)為65%、75%、85%作為正交試驗(yàn)的3個水平（圖1）.

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on zein extraction

2.1.2 提取溫度對提取效果的影響 從圖2中可以看出，在60℃以下，溫度的升高能夠使提取率增大，30～40℃時提取率有較明顯的提高，40與50℃時的提取率非常接近，50℃時稍高，60℃時提取率達(dá)到最高，而70℃時提取率反而有明顯的下降.因此，以玉米蛋白粉為原料提取醇溶蛋白的溫度不宜超過60℃.故選取40、50和60℃作為正交試驗(yàn)的3個水平.

圖2 溫度對提取效果的影響Fig.2 Effects of temperature on zein extraction

2.1.3 料液比對提取效果的影響 從圖3中可以看出，隨著料液比（m／V）的增大，提取效果呈上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶8時，提取效果最好，1∶8之后提取效果開始下降，1∶10時提取效果最差.可見，溶劑乙醇用量少會減少玉米蛋白粉中的玉米醇溶蛋白的溶出量，但溶劑用量過多也不會增加玉米醇溶蛋白的溶出量.因而，選取料液比為 1∶4、1∶6和 1∶8作為正交試驗(yàn)的3個水平.

圖3 料液比對提取效果的影響Fig.3 Effects ofmaterial／liquid ratio on zein extraction

2.1.4 提取時間對提取效果的影響 提取時間對提取效果影響很大，提取2 h比提取1 h的提取率有顯著的提高，而2 h后提取率反而逐漸下降，4 h以后的提取率與提取1 h的提取率相差不大（圖4）.可能是因?yàn)檩^長時間的加熱導(dǎo)致玉米醇溶蛋白中少部分的蛋白質(zhì)與CGM中的淀粉粘連，造成蛋白的提取率下降.因此，宜選擇1、2、3 h作為正交試驗(yàn)的3個水平.

圖4 提取時間對提取效果的影響Fig.4 Effects of extracting time on zein extraction

2.1.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1.

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，加熱攪拌提取玉米醇溶蛋白的最佳工藝條件為 A3B3C2D1，即料液比 1∶4（g／mL），60℃水浴加熱，乙醇體積分?jǐn)?shù)是 75%，提取3 h.料液比對提取效果影響最大，其次是溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)，時間對提取效果的影響程度在4個因素中最小.溫度為60℃時提取效果最好，比50℃稍高，較40℃時有顯著提高；提取1 h的效果最差，2和3 h的提取效果接近；乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時的提取率最高，比65%時的提取率稍高，體積分?jǐn)?shù)為85%乙醇的提取效果最差；料液比1∶6和1∶8的提取效果接近，1∶4時有顯著提高.

表1 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表Tab.1 L9（34）orthogonal experiment results and range analyses

2.2 酶解玉米醇溶蛋白條件的確定

由于玉米醇溶蛋白溶于高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（φ為75%乙醇）和高pH水溶液（pH 12.0），目前沒有報道蛋白水解酶在該環(huán)境中仍具有水解活力，因此我們將玉米醇溶蛋白提取烘干后用pH 12.0的NaOH-Na2HPO4緩沖溶液溶解.在如此高pH溶液中有活力的酶不多，我們選擇蛋白酶K和堿性蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn).由于過多的醇溶蛋白底物會對酶活性產(chǎn)生抑制作用，因此本試驗(yàn)的底物量為0.628 mg／mL（圖5）.參考蛋白酶K和堿性蛋白酶單獨(dú)水解的最佳作用條件，本試驗(yàn)中，2種酶的試驗(yàn)條件分別設(shè)為：0.05 mg蛋白酶K、反應(yīng)時間20 min、反應(yīng)溫度35℃；0.05 mg堿性蛋白酶、反應(yīng)時間15 min、反應(yīng)溫度45℃.分別采取以下4種加酶順序進(jìn)行反應(yīng)：只加蛋白酶K；只加堿性蛋白酶；先加蛋白酶K反應(yīng)后再加堿性蛋白酶、先加堿性蛋白酶反應(yīng)后再加蛋白酶K.

圖5 底物質(zhì)量濃度對酶解的影響Fig.5 Effects of substratemass concentration on zein enzymatic hydrolysis

采用pH-stat法及SN-TCA指數(shù)法分別測定4種加酶方式下玉米醇溶蛋白的水解度，據(jù)此選出最好的酶解方法，結(jié)果見表2和表3.

表2 pH-stat法測定玉米醇溶蛋白水解度Tab.2 Enzymatic hydrolysis degree of zein determ ined by pH-statmethod

表3 SN-TCA指數(shù)法測定玉米醇溶蛋白水解度Tab.3 Enzymatic hydrolysis degree of zein determ ined by SN-TCA method

3 討論與結(jié)論

隨著Evans等［12］在20世紀(jì)40年代開始研究玉米醇溶蛋白的提取，目前醇溶蛋白的研究已經(jīng)在多種材料上展開，如水稻、椰子、小麥、高粱等，提取的試劑也很多，如乙醇、乙二醇、異丙醇等［13-15］.考慮到后續(xù)產(chǎn)品的食用價值，本試驗(yàn)采用乙醇提取.根據(jù)玉米醇溶蛋白提取的統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，提取玉米醇溶蛋白的最佳工藝條件為 A3B3C2D1，即料液比 1∶4（g／mL），60℃水浴加熱，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 75%，提取3 h.料液比對提取效果影響最大，其次是溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)，時間對提取效果的影響程度在4個因素中最小.溫度為60℃時提取效果最好，比50℃稍高，較40℃時有顯著提高；提取1 h的效果最差，2和3 h的提取效果接近；乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時的提取率最高，比體積分?jǐn)?shù)為65%時的提取率稍高，85%乙醇的提取效果最差；料液比1∶6和1∶8的提取效果接近，料液比為1∶4時提取效果有顯著提高.玉米醇溶蛋白質(zhì)量濃度可達(dá)15.688 mg·mL-1.

由于醇溶蛋白的溶解特性，以及色氨酸含量很少，因此醇溶蛋白的酶解產(chǎn)物快速檢測比較困難，最常用的方法為pH-stat法和SN-TCA指數(shù)法.本研究發(fā)現(xiàn)，雙酶解效果比采用單一酶水解效果好，先加蛋白酶K后加堿性蛋白酶與先加堿性蛋白酶后加蛋白酶K的水解度分別達(dá)到23.11%、27.55%（pH-stat法）和43.12%、34.67%（SN-TCA指數(shù)法）.根據(jù)pH-stat法測定的雙酶水解的水解度相差不大，而采用SN-TCA指數(shù)法測得先加蛋白酶K后加堿性蛋白酶的水解效果更明顯.故采用兩步酶解法可明顯提高玉米蛋白水解反應(yīng)的水解度，兩步酶解的加酶順序?yàn)橄燃拥鞍酌窴然后加堿性蛋白酶.該研究為進(jìn)一步利用玉米醇溶蛋白生產(chǎn)高附加值的短肽提供參考數(shù)據(jù).

［1］欒新紅，曹中贊，曹敏建，等.玉米蛋白多肽對豁眼鵝血清離子水平及肉品質(zhì)的影響［J］.中國家禽，2012，34（1）：11-14.

［2］吳建平.抗消化淀粉的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，25（2）：66-70.

［3］王雄，吳正奇，萬端極，等.膜酶結(jié)合制備玉米多肽的工藝研究［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2013，13（7）：2000-2003.

［4］王梅，谷文英.酶解黃粉蛋白制備可溶性肽［J］.糧油食品科技，1999，9（1）：1-3.

［5］趙國華，陳宗道，王光慈，等.改性對玉米蛋白質(zhì)功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響（Ⅰ）：酶解［J］.中國糧油學(xué)報，2006，15（3）：28-30.

［6］趙華，張英華.玉米醇溶蛋白制備與應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.糧食與飼料工業(yè)，2006（12）：16-17.

［7］段純明，董海洲，侯漢學(xué)，等.生物降解材料-玉米醇溶蛋白提取工藝的優(yōu)化研究［J］.包裝與食品機(jī)械，2008，26（3）：1-6.

［8］徐英操，劉春紅.蛋白質(zhì)水解度測定方法綜述［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（7）：173-176.

［9］檀志芬，生慶海，邱泉若，等.蛋白質(zhì)水解度的測定方法［J］.分析檢測，2005，26（7）：174-176.

［10?范遠(yuǎn)景，姬瑩瑩，張焱.大豆蛋白酶解肽的分子量分布及抑制ACE活性關(guān)系研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（10）：57-61.

［11］袁斌，呂桂善，劉小玲.蛋白質(zhì)水解度的簡易測定方法［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2002，21（2）：113-115.

［12］EVANS C D，MANLEY R H.Ternary solvents for zein［J］.Ind Eng Chem，1944，36（5）：408-410.

［13］蔣冬花，楊寶峰，蔡敏杰，等.水稻醇溶蛋白提取條件和總含量分布［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（3）：174-178.

［14］鄭亞軍，李艷，趙松林，等.椰肉中醇溶蛋白抗氧化活性［J］.熱帶作物學(xué)報，2009，30（7）：1035-1038.

［15］王偉，印麗萍，劉許佳，等.種子醇溶蛋白提取及檢測條件探索［J］.西北植物學(xué)報，2007，27（1）：21-27.

【責(zé)任編輯 李曉卉】