肖田安，懷彬彬，李帥鵬，陳杖榴，黃顯會

（1廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所，廣東廣州 510230；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

伊維菌素（Ivermectin，IVM）屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，因其廣譜、高效、低毒的特性被廣泛應(yīng)用于動物體內(nèi)外多種寄生蟲的治療.同時伊維菌素與其他抗寄生蟲藥無交叉耐藥性，國內(nèi)外亦出現(xiàn)伊維菌素搭配其他不同種類藥物的復(fù)方制劑以期得到更廣、更好的抗寄生蟲效果［1-2］.目前，伊維菌素的劑型研究有很多種，包括注射液、乳劑、噴劑、預(yù)混劑、澆潑劑、片劑、緩釋巨丸劑、粉劑等，獸醫(yī)臨床批準(zhǔn)使用且應(yīng)用最多的劑型還是普通注射劑.但是普通注射劑存在單次給藥藥效維持時間較短，需多次給藥的缺點［3］.目前國外已經(jīng)成功研制出伊維菌素長效控釋劑，并投入應(yīng)用.微球（Microspheres，MS）是近些年出現(xiàn)并快速發(fā)展的新型長效控釋劑，以天然或人工合成的高分子材料作為藥物載體，具有控制釋放、靶向給藥、降低毒副作用等特點.微球制劑在人醫(yī)上應(yīng)用廣泛，獸醫(yī)中的應(yīng)用主要集中在疫苗制備和皮下埋植促生長等領(lǐng)域［4］，少數(shù)開始應(yīng)用于抗寄生蟲藥控制體內(nèi)外寄生蟲［5-6］.研究伊維菌素微球的藥代動力學(xué)（簡稱藥動學(xué)），可準(zhǔn)確認(rèn)識其在體內(nèi)的釋藥規(guī)律.本試驗旨在通過對伊維菌素聚乳酸（Poly lactic acid，PLA）、乙交酯丙交酯共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）微球在犬體內(nèi)藥動學(xué)的研究，評價其體內(nèi)釋藥特征，為伊維菌素長效控釋制劑的研制及在犬的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

伊維菌素對照品（含B1a質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.0%，B1b質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.14%，由中國獸藥監(jiān)察所提供），阿維菌素對照品（含B1a 99.0%，由廣東省獸藥監(jiān)察所提供），伊維菌素原料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.72%，由廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所藥物研究室提供），聚乳酸（PLA）（相對分子質(zhì)量為50 000，由山東省醫(yī)藥研究所提供），乙交酯丙交酯共聚物（PLGA）［m（LA）∶m（GA）=90∶10，由浙江省醫(yī)學(xué)院計劃生育研究所合成室提供］，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純.

伊維菌素PLA微球：平均粒徑184μm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.79%；伊維菌素PLGA微球：平均粒徑298 μm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.72%，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實驗室通過溶劑揮發(fā)法研究制備.伊維菌素微球混懸液：分別稱取伊維菌素PLA和PLGA微球適量，用稀釋液配成含伊維菌素0.05 g·mL-1的混懸液即得.伊維菌素普通注射液：稱取伊維菌素原料適量，用稀釋液配成含伊維菌素0.005 g·mL-1的混懸液即得.

1.2 儀器設(shè)備

HP1100高壓液相色譜儀（帶1046熒光檢測器，美國惠普公司），EBA-8S離心機（德國 Hettich公司），MS1型漩渦混合器（IKA公司），電子分析天平（AE 160型，瑞士Mettler公司），HY-4型調(diào)速多用振蕩器（廣州市富城儀器廠）.

1.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：取伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配成500μg·mL-1，置4℃條件下保存；臨用前用甲醇稀釋成系列工作液，當(dāng)日使用.內(nèi)標(biāo)貯備液：內(nèi)標(biāo)為阿維菌素，準(zhǔn)確稱取13.70 mg，溶于100 mL甲醇中，置4℃條件下保存；臨用前配成5.20 μg·mL-1的溶液，2～3 d內(nèi)使用.注射用稀釋液：稱取2 g羧甲基纖維素鈉，用100 mL V（吐溫20）∶V（生理鹽水）=1∶97的混合液溶解即得.衍生化試劑：按體積比2∶3∶9的比例，將N-甲基咪唑、乙酸酐和N，N-二甲基甲酰胺混合均勻即得.臨用時現(xiàn)配.

1.4 試驗動物與給藥

18只Beagle犬，購自順德實驗動物研究所，11月齡左右，平均體質(zhì)量為（11.97±0.24）kg.每犬1籠，按常規(guī)飼養(yǎng)管理，正常飲水與采食，犬糧不含任何抗寄生蟲藥物.臨床觀察1周，表現(xiàn)健康.18只Beagle犬隨機分成3組，每組6只，分別皮下注射伊維菌素普通注射液、伊維菌素PLA微球混懸液及伊維菌素PLGA微球混懸液，其中普通注射液的給藥劑量為0.3 mg·kg-1，微球組給藥劑量均為3 mg·kg-1.

1.5 血樣采集

給犬佩戴保護(hù)頭套，1人協(xié)助保定.隨機分3組，分別按“1.4”所述劑量頸部皮下注射，給藥前采集空白血樣.伊維菌素普通注射液皮下注射給藥后分別于 30 min和 1、2、4、8、12 h、1、2、4、10、16、23、30 d自前臂靜脈采集血樣.伊維菌素PLA及PLGA微球混懸液皮下注射給藥后分別于30 min和 1、2、4、8、12 h、1、2、4、10、16、23、30、35、42、49、56、70、84、98、112、126、140 d自前臂靜脈采集血樣.每次采集5 mL左右，肝素抗凝，4 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，置于-20℃冰箱，待測.

1.6 血藥濃度測定

1.6.1 血漿樣品前處理 取血漿1 mL，置于10 mL的試管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液40μL（200 ng），混合均勻，加入5 mL乙醚，加蓋，以120 r·min-1往返振蕩20 min，收集乙醚層，重復(fù)提取1次，合并2次乙醚提取液，置于尖底玻璃帶蓋離心管中，用氮氣流于50～55℃下?lián)]發(fā)至干.向上述離心管中加入200μL衍生試劑，漩渦振蕩使殘留物溶解，加蓋，置95～100℃水浴中，加熱反應(yīng)1 h，取出，在室溫下放置10 min后，加入0.3 mL乙腈，混合均勻，過膜，上機檢測.

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限 準(zhǔn)確量取950μL空白血漿，添加50μL伊維菌素對照品工作液，分別配制 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、40.0 ng·mL-1系列質(zhì)量濃度的加標(biāo)樣品，再向各樣品中加入內(nèi)標(biāo)工作液40μL（200 ng），渦旋混勻，放置 30 min.按“1.6.1”方法處理樣品，按“1.7”色譜條件進(jìn)行測定，根據(jù)結(jié)果確定最低檢測限.將伊維菌素與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積之比作為縱坐標(biāo)（y），相對應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（x）作圖，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)，共作5個批次.

1.6.3 回收率和精密度 精密吸取伊維菌素對照品工作液，加入到空白血漿中，制備低（5 ng·mL-1）、中（10 ng·mL-1）、高（20 ng·mL-1）3個質(zhì)量濃度水平的樣品.按“1.6.1”方法處理樣品，按“1.7”色譜條件進(jìn)行測定，每批次每個質(zhì)量濃度設(shè)5個平行樣品，共5個批次，以樣品伊維菌素峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后上機測定的伊維菌素峰面積之比，求得低、中、高3種濃度的回收率，分別計算批內(nèi)和批間變異系數(shù).

1.7 色譜條件

色譜柱：C18，150.0 mm×4.6 mm×3.0μm，美國Supelco公司；流動相：V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=20∶75∶5；流速：1.25 mL·min-1；進(jìn)樣體積：50μL；熒光檢測器：激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長465 nm.

1.8 藥時數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

根據(jù)血漿藥物濃度平均值-時間數(shù)據(jù)，作出藥時曲線圖.使用美國Pharsight公司藥動學(xué)軟件Winnonlin 5.2.1的非房室模型來處理伊維菌素組藥動數(shù)據(jù)；微球組用梯形法計算藥時曲線下面積（AUC），血漿峰濃度和達(dá)峰時間為實測值.計算出每只試驗犬的藥動學(xué)參數(shù)，然后計算平均值（ˉX）及標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）.采用方差非齊性t檢驗分析數(shù)據(jù)的顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的適用性

按照上述色譜條件，伊維菌素、阿維菌素與血漿中的其他組分分離良好，相互之間無干擾，峰型較佳，阿維菌素和伊維菌素的保留時間分別為7.2和11.8 min左右，保留時間穩(wěn)定，色譜圖見圖1～圖3.

圖1 犬空白血漿樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank plasma samples of dogs

圖2 犬空白血漿加入內(nèi)標(biāo)阿維菌素200 ng·mL-1和伊維菌素2 ng·mL-1的樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma samples of dogs spiked with avermectin 200 ng·mL-1 and ivermectin 2 ng·mL-1

圖3 實測給藥后犬血漿樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of plasma samples of dogs after administration

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限

空白血漿添加伊維菌素的質(zhì)量濃度在1～40 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為 y=0.007 4x+0.000 5，相關(guān)系數(shù)r=0.997 3.該方法檢測限為0.5 ng·mL-1，定量限為1 ng·mL-1，結(jié)果見表1.表明該方法靈敏度高，能滿足血漿中伊維菌素檢測需要.

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸1）Tab.1 Standard curve regression

2.3 回收率和變異系數(shù)

按上述處理方法，血漿中的伊維菌素的絕對回收率在70.00%～99.30%，其中5 ng·mL-1水平的回收率為（80.84±1.48）%，批內(nèi)變異系數(shù)為6.27%～10.60%，批間變異系數(shù)為8.17%.10 ng·mL-1水平的回收率為（83.39±1.73）%，批內(nèi)變異系數(shù)為4.84%～8.67%，批間變異系數(shù)為9.28%.20 ng·mL-1水平的回收率為（84.61±1.51）%，批內(nèi)變異系數(shù)為6.14%～7.53%，批間變異系數(shù)為7.97%.該方法回收率較高，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均不超過20.00%，滿足生物樣品測定要求.

2.4 血藥濃度和主要動力學(xué)參數(shù)

犬皮下注射伊維菌素普通注射液（0.3mg·kg-1）、伊維菌素PLA及PLGA微球混懸液（3 mg·kg-1）后的藥時曲線見圖4.

采用Winnonlin 5.2.1的非房室模型分析方法處理藥時數(shù)據(jù)，得到藥動學(xué)參數(shù)，計算出各組參數(shù)平均值見表2.從表2可以看到，試驗犬皮下注射伊維菌素普通注射液后，峰濃度（Cmax）為（44.3±5.1）ng·mL-1，達(dá)峰時間（tmax）為（1.33±0.21）d，吸收半衰期（t1／2ka）和消除半衰期（t1／2kel）分別為（0.17±0.02）和（4.96±0.66）d，平均滯留時間（MRT）為（7.40±0.95）d，藥時曲線下面積（AUC0-∞）為（323.26±23.56）ng·mL-1·d.皮下注射伊維菌素PLA及 PLGA微球混懸液組，Cmax分別為（56.2±5.9）、（48.6±2.7）ng·mL-1，tmax分別為（0.83±0.11）、（0.81±0.13）d，AUC0-∞分別為（1 041.47±73.73）、（1 461.77±102.54）ng·mL-1·d.另外，從圖4可以看出，PLA微球組藥-時曲線明顯出現(xiàn)3個峰，PLGA微球組出現(xiàn)2個峰.

圖4 伊維菌素、伊維菌素PLA和PLGA微球混懸液在犬皮下給藥后的藥時曲線Fig.4 Plasma concentration-time curve of IVM and IVM PLA／PLGA-MS injected subcutaneously to dogs

表2 犬皮下注射伊維菌素普通注射液（0.3 mg·kg-1）、伊維菌素PLA及PLGA微球混懸液（3 mg·kg-1）的藥動學(xué)參數(shù)Tab.2 Summary of themean（±SE）plasma pharmacokinetic parameters in dogs adm inistered a single subcutaneous injection of IVM（0.3 mg·kg-1），IVM-PLA-M S and IVM-PLGA-MS（3 mg·kg-1）respectively

3 討論與結(jié)論

3.1 伊維菌素普通注射液在犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征

本試驗 Beagle犬經(jīng)皮下注射伊維菌素（0.3 mg·kg-1）后，Cmax為 44.3 ng·mL-1，AUC為 323.26 ng·mL-1·d，分別是劉仁杰［7］報道的皮下注射 0.1 mg·kg-1時 Cmax12.76 ng·mL-1的 3.5倍，AUC 79.52 ng·mL-1·d的4.1倍，這可能是給藥劑量相差3倍和動物個體差異造成的；tmax為1.33 d，和劉仁杰［7］報道（1.47 d）基本一致.本試驗中，犬皮下給藥后，消除半衰期為4.96 d，血藥質(zhì)量濃度可監(jiān)測到約30 d.伊維菌素皮下注射給藥后，消除緩慢是因為注射部位刺激性炎癥反應(yīng)和藥物結(jié)晶性沉淀延緩了藥物的吸收［8］.在不同種屬動物中，皮下注射伊維菌素的藥動學(xué)特征表現(xiàn)出很大的差異.消除半衰期以兔最短，為 1.5［6］和 1.8 d［9］，馬為 3.7 d，山羊 4.03 d［10］，綿羊 5.1 d［11］，豬為 5.4 d［12］，牛最長的報道是8.3 d［13］.

3.2 伊維菌素微球在犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征

伊維菌素PLA和PLGA微球混懸液，與伊維菌素普通注射液相比，雖然劑量大10倍，但產(chǎn)生的峰濃度沒有差異（P＞0.05），維持1 ng·mL-1以上的時間卻長達(dá)140 d以上，AUC0-∞比普通組大3～5倍.PLA、PLGA微球混懸液的第1個峰濃度產(chǎn)生的時間分別為0.83、0.81 d，達(dá)峰時間比普通組（1.33 d）略快.伊維菌素PLA微球混懸液在第23和第42天又分別出現(xiàn)2個藥峰，伊維菌素PLGA微球混懸液在第42天出現(xiàn)第2個峰.肖田安［14］報道的山羊經(jīng)皮下注射伊維菌素PLA、PLGA微球混懸液，第2個峰出現(xiàn)在20～30 d之間，PLGA微球混懸液的血藥質(zhì)量濃度可監(jiān)測到105 d，PLA微球混懸液在133 d以后.其藥-時曲線特征與在犬體內(nèi)極其相似.顯然，第1個峰的出現(xiàn)是因為微球表面黏附的伊維菌素所致的突釋效應(yīng)，及少量伊維菌素從微球擴散而共同產(chǎn)生的，第2個峰則是PLA和PLGA微球在皮下降解與溶蝕，引起伊維菌素的釋放與繼續(xù)擴散而產(chǎn)生的結(jié)果.第2個峰出現(xiàn)的時間只與聚合物有關(guān)，聚合物相對分子質(zhì)量的大小、共聚物的比例及微球大小的選擇等制備工藝都會影響藥物釋放過程.因為聚酯類微球系統(tǒng)釋藥前有一個遲滯期（lag period），直到聚合物相對分子質(zhì)量經(jīng)水解減少到某一臨界值，才開始釋放藥物，故在第1峰和第2峰之間出現(xiàn)了低谷.

3.3 伊維菌素微球的應(yīng)用前景

伊維菌素具有使用劑量低、作用強的特點.已有研究表明，伊維菌素在糞中的質(zhì)量濃度為1 ng·g-1時對某些糞中繁殖的昆蟲具有殺滅作用［15］，當(dāng)血藥質(zhì)量濃度在2 ng·mL-1以上時，牛疥螨蟲產(chǎn)卵率減少到50%以下［16］.體外試驗表明，伊維菌素在0.1 ng·mL-1下明顯抑制盤尾絲蟲的3和4期幼蟲的蛻變，半數(shù)有效量（50%effective dose，ED50）為 0.19 ng·mL-1［17］.本 試驗 犬 血 漿 中 伊 維 菌 素 維 持 1 ng·mL-1以上質(zhì)量濃度的時間卻長達(dá)140 d以上，提示伊維菌素PLA和PLGA微球?qū)θ尿?qū)蟲作用有可能維持在140 d以上.綜上所述，微球混懸液比普通注射劑的優(yōu)點是延長了釋藥時間和驅(qū)蟲作用期，排除或減少了產(chǎn)生毒副作用的可能性（微球本身降解后也無毒副作用），表明伊維菌素微球制劑具有開發(fā)研究的價值和廣闊的市場前景.本試驗通過皮下注射給藥研究了伊維菌素普通注射液與PLA、PLGA微球混懸液在犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征，試驗結(jié)果表明，伊維菌素2種微球均具有明顯的緩釋特性，對獸醫(yī)臨床上預(yù)防和治療犬的腸道線蟲、耳螨、疥螨、心絲蟲和微絲蚴等體內(nèi)外寄生蟲病有重要意義，可以進(jìn)一步作為臨床新制劑開發(fā)應(yīng)用.

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【責(zé)任編輯 柴 焰】