李飛鶴杜杰 陳廷貴*栗亞云 席小莉 張立偉

（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學分子科學研究所，山西太原030006）

連翹苷快速提取純化工藝研究*

李飛鶴**杜杰 陳廷貴***栗亞云 席小莉 張立偉

（化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西大學分子科學研究所，山西太原030006）

連翹是最廣泛使用的傳統(tǒng)中藥之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化活性等重要的藥理作用，而連翹苷是連翹的主要生物活性成分。為了從連翹葉中快速簡便地提取、分離和純化得到純度較高的連翹苷，試驗采用無水乙醇和體積濃度85%乙醇回流提取，大孔樹脂柱層析和石油醚萃取的方法分離，重結晶法進行純化，經(jīng)不同組合試驗以確定最佳制備工藝。通過HPLC測定比較所得連翹苷的含量、純度，最終確定了以無水乙醇回流提取，石油醚萃取分離，重結晶純化的工藝流程，通過該方法可以得到純度達90%的連翹苷。

連翹葉；連翹苷；高效液相色譜法；提??；分離；純化

連翹為木犀科連翹屬植物，是臨床常用傳統(tǒng)中藥之一?！吨袊幍洹分忻枋觯哼B翹具有清熱解毒，消腫散結，疏散風熱的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明：連翹具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗內(nèi)毒素、抑制彈性蛋白酶活力、抑制磷酸二酯酶、強心利尿、解熱、抗肝損傷及治療肝炎等作用。

連翹化學成分較多，據(jù)目前報道，主要含有木脂素類、萜類、揮發(fā)油類、黃酮類、香豆精、苯乙醇及其甙類等。其中連翹苷是其最主要的質(zhì)量控制指標，連翹藥材中連翹苷含量不得少于0.15%。連翹苷為木脂素苷類化合物，其化學式為C27H34O11，分子量為534，熔點為181℃，難溶于水，易溶于乙醇、甲醇等有機溶劑。

大量的研究結果證明，連翹葉中的化學成分與連翹果實中的化學成分有非常好的一致性，而且連翹葉中有許多化學成分的含量遠遠高于連翹果實，如連翹葉中連翹苷約占5%，連翹果實中連翹苷約占0.2%，含量差別超過20倍。由于連翹葉中有許多化學成分的含量遠遠高于連翹果實，所以連翹葉雖不能入藥，但在制備單體化合物如連翹苷等方面具有較大的優(yōu)勢，同時也大大節(jié)省了連翹果實在制備單體化合物中的浪費現(xiàn)象，充分利用了秋季連翹葉落葉的價值。

本文設計了連翹苷的2種提取方法、2種分離方法和1種純化方法，通過各種方法的不同組合試驗，以確定快速簡便地制備高純度連翹苷的工藝流程，為連翹苷的藥理作用研究打下基礎，同時為其他研究者快速制備出高純度連翹苷提供一定參考。

1 儀器與材料

旋轉蒸發(fā)儀，上海申生科技儀器有限公司；SHZ-C型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Scientz-12N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ3200超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；微型高速萬能試樣粉碎機，黃燁市齊家容科學儀器廠；鼓風數(shù)顯干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SpectraMax 190酶標儀，美國Molecular Devices公司。

連翹葉，于2012年8月份采于山西大學校園內(nèi)。

2 試驗方法

2.1 高效液相色譜條件及方法學考察

2.1.1 分析條件

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。色譜柱為SHMADZU VP-ODS C18（250 mm× 4.6 mm），流動相為水（A）：乙腈（B）體積比為75∶25；流速為1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25℃；檢測波長277 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備

取連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取待測品粉末約0.1 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，精密加入體積濃度70%甲醇8 mL，搖勻，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再用體積濃度70%的甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 測定法

分別精密吸取對照品溶液與待測品溶液各10μL，注入液相色譜儀，以連翹苷對照品的峰面積為對照，計算連翹苷的含量。待測成分色譜峰以連翹苷對照品色譜峰相對保留時間確定。連翹苷的峰位，其相對保留時間應在規(guī)定值的5%范圍之內(nèi)。

2.1.5 線性關系的考察

精密量取對照品溶液1 mL，分別配置質(zhì)量濃度為15.62 μg/mL、31.25μg/mL、62.50μg/mL、135.00 μg/mL、270.00 μg/mL、540.00 μg/mL的標準溶液。按2.1.1的測試條件檢測峰面積，平行測定3次，以連翹苷的進樣質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，以連翹苷的峰面積為縱坐標，線性回歸，得連翹苷的回歸方程為y=7 961.3x+81.412，R2=0.999 8，結果表明連翹苷在15.62 μg/mL～540.00 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關系。

2.2 連翹苷提取溶劑的選擇

2.2.1 無水乙醇提取

準確稱取連翹葉200.0 g，每次加入2 000 mL無水乙醇回餾2次，每次l.5 h，將提取液過濾；濾液混合后濃縮至糊狀，加熱水煮沸，趁熱過濾，得粗產(chǎn)物，棄去沉淀，濾液濃縮至200 mL，然后置于4℃冰箱保存4 h～8 h；待析出沉淀后，減壓抽濾，取沉淀，得到粗產(chǎn)物。干燥后稱重并檢測純度。

2.2.2 體積濃度85%乙醇提取

準確稱取連翹葉200.0 g，每次加入2 000 mL 85%乙醇回餾2次，每次l.5 h，提取方法同2.2.1。

2.3 連翹苷分離方法的選擇

2.3.1 大孔樹脂吸附

將2.2.1、2.2.2所得的乙醇粗提物分別用體積濃度30%乙醇溶解，加入大孔樹脂柱吸附，先用8（倍體積）BV體積濃度30%乙醇洗雜質(zhì)，再用18BV體積濃度60%乙醇溶液洗脫，最后再用體積濃度80%乙醇洗脫，分別收集洗脫液，洗脫液濃縮回收乙醇，濃縮液放置4℃冰箱中結晶，濾出得粗結晶；冷凍干燥后分別稱重并檢測純度。

2.3.2 石油醚萃取

將2.2.1和2.2.2所得的乙醇粗提物分別取1 g，用體積濃度50%的乙醇溶液，加入適量的石油醚，混勻，待靜置分層后，回收下層液體濃縮回收乙醇，濃縮液放置冰箱中結晶，濾出得粗結晶，干燥后稱重并檢測純度。并將石油醚萃取的上下兩層溶液分別用酶標儀在200 nm～800 nm之間掃描，測其吸收峰。

2.4 連翹苷重結晶純化

將得到的粗結晶用無水乙醇溶解，稍微加熱，待全部溶解后冷卻，放置冰箱中結晶，12 h后，減壓抽濾，得到連翹苷晶體，重復2～3次。最后真空干燥，稱量并測其純度。

3 結果分析

3.1 連翹苷的提取、分離、純化

3.1.1 連翹葉－無水乙醇提取－大孔樹脂柱層析－重結晶結果

將200 g連翹葉經(jīng)過無水乙醇提取得到粗提物3.95 g，其純度為60.23%。經(jīng)大孔樹脂分離、冷凍干燥最終得到以下組分：體積濃度30%乙醇洗脫液濃縮干燥所得物為1.06 g，HPLC未能檢測到連翹苷，表明體積濃度30%乙醇無法將其洗脫。體積濃度60%乙醇洗脫液濃縮干燥后得到2.60 g，其連翹苷純度為66.71%。體積濃度80%乙醇洗脫液濃縮干燥后有0.06 g，其連翹苷純度為46.86%。隨后將純度達66.71%的連翹苷粗結晶進行數(shù)次重結晶。

3.1.2 連翹葉－體積濃度85%乙醇提取－大孔樹脂柱層析結果

將200 g連翹葉經(jīng)過體積濃度85%乙醇提取得到粗提物34.54 g，其純度為9.75%。經(jīng)大孔樹脂分離、冷凍干燥后，最終得到以下組分：體積濃度30%乙醇洗脫液濃縮干燥所得物為23.44 g，HPLC未能檢測到連翹苷。體積濃度60%乙醇洗脫液濃縮干燥后得到10.15 g，其連翹苷純度為30.80%。體積濃度80%乙醇洗脫液濃縮干燥后，其連翹苷純度為0.51%。從以上數(shù)據(jù)可知，體積濃度60%乙醇洗脫得到的連翹苷粗結晶為10.15 g，純度達30.80%，由于其純度較低，未進行重結晶。

3.1.3 連翹葉－無水乙醇提?。兔演腿。亟Y晶結果

將200 g連翹葉經(jīng)無水乙醇提取，石油醚萃取后，對萃取溶液的上下層分別在酶標儀上測其200 nm～800 nm之間的吸光度曲線，圖略。由萃取溶液上層吸光度曲線可知，石油醚已把葉綠素A和葉綠素B萃取干凈。由萃取溶液下層吸光度曲線可知，下層乙醇溶液中已沒有葉綠素A和葉綠素B雜質(zhì)。下層乙醇溶液濃縮，靜置沉淀，過濾干燥后得到連翹苷粗結晶2.88 g，純度為66.93%，隨后進行數(shù)次重結晶。

3.1.4 連翹葉－體積濃度85%乙醇提取－石油醚萃取結果

將200 g連翹葉經(jīng)體積濃度85%乙醇提取，石油醚萃取后，下層溶液濃縮，靜置沉淀，過濾干燥后得到連翹苷1.59 g，純度為50.65%。由于其純度較低，未再進行重結晶。

4 討論

由以上試驗可知，連翹葉經(jīng)無水乙醇提取比用體積濃度85%乙醇提取效果好。雖然體積濃度85%乙醇的提取率較高，但由于純度較低，再經(jīng)大孔樹脂或石油醚萃取后，提取率和純度反而變得較低；石油醚萃取所得連翹苷粗品質(zhì)量較大，純度也相對較高，考慮到大孔樹脂柱層析耗時過長，操作過程繁瑣，選擇石油醚萃取較好。總之，選擇連翹葉－無水乙醇提?。兔演腿。亟Y晶提取連翹苷效果最好。

在有關制備連翹苷的文獻中，有的用堿性溶液提取，使得連翹苷容易分解，且需進行大孔樹脂、氧化鋁柱層析，耗時會大大增加，有的未去除葉綠素，將很難達到滿意結果。本研究運用無水乙醇提取－石油醚萃?。亟Y晶方法，快速簡便地獲得了高純度的連翹苷，純度達到90%以上，提取率為1.21%，這為連翹苷的藥理作用研究打下了基礎，也為其他研究者快速獲得高純度連翹苷提供了一種可行方法。雖與文獻中連翹苷含量98%，提取率為1.64%相比，本試驗方法得到的連翹苷的純度和提取率相對較低，會浪費一定的連翹葉資源，但相對于經(jīng)過復雜制備過程獲取連翹苷，或者高價大量購買連翹苷標準品做體外、體內(nèi)藥理試驗，尤其是數(shù)星期的體內(nèi)藥理試驗，本研究方法值得提倡。

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表5 正交試驗因素與水平設計

由正交因素水平表，可以設計3因素3水平的正交試驗，正交試驗結果與分析見表6。

表6 正交試驗結果與分析

3.2 極差分析

根據(jù)正交試驗表的試驗數(shù)據(jù)，由極差分析的結果，明顯可以看出極差越大，說明該因素對指標的影響越大。得出B＞C＞A，即影響該生產(chǎn)工藝的主次關系依次為：木糖醇的添加量＞復合穩(wěn)定劑添加量＞南瓜漿添加量。生產(chǎn)木糖醇南瓜酸奶的最優(yōu)組合為A2B2C2，因此了確定最佳工藝參數(shù)為南瓜漿的添加量為7.5%，木糖醇的添加量為8.0%，復合穩(wěn)定劑添加量為0.4%，發(fā)酵劑的添加量為4.0%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為4 h。

4 結論

由上述試驗和分析，可以得出木糖醇酸奶的最佳工藝為南瓜漿的添加量為7.5%，木糖醇的添加量為8.0%，復合穩(wěn)定劑添加量為0.4%，發(fā)酵劑的添加量為4.0%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為4 h，采用該工藝制作出來的酸奶呈現(xiàn)淺黃色，凝固性好，酸甜適度，有濃郁的南瓜奶香味，口感細膩。在木糖醇的單因素試驗中，木糖醇的添加量對于指標的影響并不明顯，因此要通過正交試驗驗證最優(yōu)的工藝組合。

在酸奶發(fā)酵結束時，要將酸奶及時轉移，必要時要對酸奶采取水淋等方式來及時降溫，這樣才能避免乳酸菌的過分發(fā)酵，導致酸奶酸味過重，口感差。木糖醇南瓜酸奶有清涼獨特的口感，營養(yǎng)豐富，兼保健美味于一體，符合當代人們的生活需求，具有廣闊的發(fā)展前景。

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Rapid extraction and purification of forsythin from forsythia suspensa leaves

LI Fei-he**DUJie CHENTing-gui***LI Ya-yun XI Xiao-li ZhangLi-wei
（Key laboratory of chemical biology and molecular engineering ofministry of education，Institute ofmolecular science，Shanxi university，Shanxi Taiyuan 030006，China）

Forsythia suspensa is one of most widelyused traditional Chinese medicines, and possesses important biologicalactivities, including antibacterial, antiviral, anti- inflammatory and antioxidant activities.Forsythin is the main bioactive component of forsythia suspensa.This paper aimed to obtain highly purified forsythin fromforsythia suspensa leaves quickly and easily, and to study its pharmacological effects in future.The study designed a series of methods, extraction methods containing anhydrous ethanol and 85% ethanol extract, separation methods adoptingmacroporous resin column chromatography and petroleum ether extraction, purification method employing recrystallization.Through HPLC determined the content and purityofforsythin, a bettermethodwas foundedwhich included anhydrous ethanol extraction, separation of petroleumether and recrystallization.At last，a certain amount of 90%purity forsythin had been extracted by the method.

forsythia suspensa leaves；forsythin；high performance liquid chromatography；extractin；separation；purification

TS272

A

1673-6044（2014）02-0032-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.02.012

山西省科技基礎條件平臺建設項目（2012091015）。

**李飛鶴，女，1986年出生，山西大學分子科學研究所無機化學專業(yè)在讀研究生。

***陳廷貴，通訊作者，E-mail：chentg@sxu.edu.cn.

2014-03-26