關(guān)棣鍇，胡文忠，樸永哲，陳 晨，姜愛麗，王運照

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌熒光定量PCR快速檢測方法的建立及初步應(yīng)用

關(guān)棣鍇1，2，胡文忠2，*，樸永哲2，陳 晨2，姜愛麗2，王運照2

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

以單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的hly基因為靶基因，用Primer 5.0設(shè)計了特異性兼并引物，建立熒光定量PCR檢測方法。并用陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、不同菌株對該方法的特異性、靈敏度進(jìn)行了驗證，且在人工污染鮮切甜瓜上對該方法進(jìn)行了初步應(yīng)用。結(jié)果表明，建立的檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，對陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為7.69×10copies/μL，對人工污染的鮮切甜瓜中單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的最低檢出限為3.11×10cfu/mL。

單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌，熒光定量PCR，hly，鮮切甜瓜

單 核 細(xì) 胞 增 生 性 李 斯 特 氏 菌（ Listeria monocytogenes，L.monocytogenes）是 李 斯 特 氏 菌 屬 中唯一一種能引起人畜共患的食源性致病菌，由該菌誘發(fā)李斯特菌病可引起人類腦膜炎、敗血癥等病癥，致死率高達(dá)30%。L.monocytogenes廣泛存在于自然界中，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是威脅人類健康的主要病原菌之一，因此研制出更快、更有效的檢測方法對于預(yù)防由L.monocytogenes引發(fā)的食物中毒和食源性疾病具有重要指導(dǎo)意義。目前熒光定量PCR快速檢測食品中L.monocytogenes的方法主要有兩種，SYBR GreenⅠ法和TaqMan法，本研究采用前者，該法簡便快捷、靈敏度高于后者、價格便宜，具有較好的大批量檢測食源性致病菌的應(yīng)用前景。同時本研究以L.monocytogenes的hly基因為靶基因，設(shè)計的特異性兼并引物可對不同來源的L.monocytogenes進(jìn)行檢測，擴(kuò)大了檢測范圍。用陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、不同菌株、人工污染的鮮切甜瓜對建立的方法的特異性、靈敏度進(jìn)行驗證后表明，該法特異性較好，靈敏度高，可為鮮切果蔬的食品安全與控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 見表1；鮮切伊麗莎白瓜 已切分好，購于附近超市；MightyAmp?for Real Time（SYBR? Plus）、核酸純化試劑盒、pMD18-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、小量質(zhì)粒提取試劑 寶生物工程（大連）有限公司；磁珠法細(xì)菌DNA提取試劑盒 北京普華仕科技發(fā)展有限公司。

Thermo Scientific PikoReal實 時 PCR 儀 、Thermo Scientific Arktik熱循環(huán)儀 Thermo公司。

表1 菌株及來源Table 1 Strains and source

1.2 引物的設(shè)計與合成

從GenBank數(shù) 據(jù)庫中 獲 得 所 有L.monocytogenes的hly基因序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，找出序列中相似和差異的片段，根據(jù)相似的基因片段采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，并找出兼并堿基，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長度為188bp，引物由寶生物工程（大連）有限 公 司 合 成 。 兼 并 引 物 的 序 列 如 下 ：Forward 5’-GYGGRAAATCTGTCTCAGGTGAT-3 ’；Reverse 5’-RGCAATGGGAACTCC TGGTG-3’。合成好的兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線BLAST比對分析，結(jié)果表明與L.monocytogenes同源性良好。

1.3 細(xì)菌DNA基因組的提取

L.monocytogenes經(jīng)過TSBYE增菌液37℃過夜培養(yǎng)后取純培養(yǎng)菌液1mL于Tube管中，12000r/min離心2min，菌沉淀用磁珠法細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組，并按其操作說明進(jìn)行操作。然后通過紫外分光光度計測定OD260、OD280值以確定提取的DNA的濃度及純度，其中DNA濃度根據(jù)OD260換算得出，DNA純度根據(jù)OD260/OD280確定。

1.4 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以L.monocytogenes的基因組DNA為模板，用兼并引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收并純化擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂平板篩選出疑似陽性的菌落，提取其質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增鑒定為陽性的于寶生物工程（大連）有限公司測序。用紫外分光光度計對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行純度和濃度的分析，然后進(jìn)行梯度稀釋作為陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 建立的熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

本實驗所采用的反應(yīng)體系為20μL：MightyAmp for Real Time（SYBR ? Plus）10μL ，上 下 游 引 物（10μmol/L）各0.4μL，模板2.0μL，無菌水7.2μL。反應(yīng) 條 件 為 ：98℃ ，2min 預(yù) 變 性 ；98℃ ，30s；58℃ ，30s；72℃，30s；擴(kuò)增40個循環(huán)；58℃結(jié)束后開始收集熒光信號。

1.6 熒光定量PCR特異性檢測

以按照1.3提取的5株L.monocytogenes和15株其他非L.monocytogenes菌株的基因組為模板，根據(jù)方法1.5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，驗證建立的檢測方法的特異性。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度的確定

以方法1.4制備的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板（濃度為7.69×108～7.69×10copies/μL），按照方法1.5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定建立的檢測方法的靈敏度。

1.8 人工污染鮮切甜瓜最低檢出限的確定

取1mL 37℃過夜培養(yǎng)的L.monocytogenes菌液噴于10g鮮切甜瓜上，加入90mL TSBYE，37℃增菌過夜。然后用均質(zhì)器拍打，均質(zhì)液用1%的蛋白胨水進(jìn)行10倍倍比稀釋成8個稀釋度，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。取上述各稀釋度的菌液1mL，每個稀釋度接種1個平板，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計數(shù)。同時再取上述各稀釋度的菌液1mL，12000r/min離心2min后按照方法1.3提取DNA，然后按照方法1.5進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌hly基因的PCR擴(kuò)增與測序

提取L.monocytogenes的基因組后，用合成的兼并引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。由圖1可知，擴(kuò)增的條帶大小與預(yù)期的188bp接近，經(jīng)寶生物工程（大連）有限公司測序，測序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與序列完全相符，說明設(shè)計的兼并引物能夠擴(kuò)增出特異的電泳條帶。

圖1 兼并引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR of degenerate Primer

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒通過PCR和酶切鑒定后，將呈陽性重組質(zhì)粒送往寶生物工程（大連）有限公司測序后，與NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線BLAST比對分析，結(jié)果表明擴(kuò)增 產(chǎn) 物 與 L.monocytogenes的hly基 因 相 應(yīng) 區(qū) 域 99%同源。

2.3 熒光定量PCR特異性檢測

用建立的熒光定量PCR方法檢測20株實驗菌株，結(jié)果見圖2、圖3，5株L.monocytogenes（ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、ATCC 15313、GIM 1.229）均有擴(kuò)增曲線生成，結(jié)果為陽性，且循環(huán)閾值均小于30，其他15株非L.monocytogenes菌株及陰性對照無菌水的檢測結(jié)果為陰性，雖然有個別菌株生成擴(kuò)增曲線，但由于在35個循環(huán)之后生成，且觀察其熔解曲線可知在80～90℃沒有生成特異性熔解峰，故實驗證明建立的該熒光定量PCR方法特異性較好。

圖2 特異性擴(kuò)增曲線Fig.2 Primary curve of specificity

圖3 特異性熔解曲線Fig.3 Melting curve of specificity

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度的確定

以制備的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得熒光定量PCR擴(kuò)增曲線、熔解曲線，見圖4、圖5。以各陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。由圖6可知，循環(huán)閾值（Cq值）和各陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9993，線性方程為：y=-3.73x+ 44.696。

圖4 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig.4 Primary curve of plasmid standards

圖5 陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線Fig.5 Melting curve of plasmid standards

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve

由圖4可以得出當(dāng)陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為7.69×10copies/μL時，仍有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明建立的檢測方法靈敏度為7.69×10copies/μL。

2.5 人工污染鮮切甜瓜最低檢出限的確定

方法1.8中人工污染的鮮切甜瓜原菌液及8個稀釋度菌液的菌落計數(shù)結(jié)果為約3.11×100～3.11×108cfu/mL，且按照1.5進(jìn)行的熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7、圖8所示。由圖7可知，菌濃度為3.11×10cfu/mL時仍有擴(kuò)增曲線，Cq值均小于35，而菌濃度為3.11cfu/mL時未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明該方法對鮮切甜瓜中L.monocytogenes的最低檢出限為3.11×10cfu/mL。以菌濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的Cq值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖9。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9958，表示線性關(guān)系良好，線性方程為：y=-3.19x+37.38。

圖7 人工污染鮮切甜瓜的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.7 Primary curve of real time PCR of artificial contamination fresh cut melon

圖8 人工污染鮮切甜瓜的熒光定量PCR熔解曲線Fig.8 Melting curve of real time PCR of artificial contamination fresh cut melon

圖9 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve

3 結(jié)論與討論

L.monocytogenes在自然界分布廣泛，可以造成多種食品污染。2011年9月美國爆發(fā)大規(guī)模甜瓜中李斯特菌中毒事件，導(dǎo)致全美24個州出現(xiàn)李斯特菌感染病例，截止2011年12月，30人確認(rèn)因感染李斯特菌 死 亡[1]。 該 事 件 表 明 植 物 性 食 品 同 樣 存 在 污 染L.monocytogenes的危險，從而對人體健康造成危害，應(yīng)予以高度重視。鮮切果蔬作為即食性食品，存在新鮮、健康、衛(wèi)生、方便等優(yōu)點，深受人們青睞。但在其加工及儲運過程中如果不注意衛(wèi)生，也會受到微生物等的污染。而鮮切果蔬一旦受到微生物的污染，將會帶來巨大的損失。因此本研究以此為切入點，選取鮮切甜瓜為材料，進(jìn)行了熒光定量PCR快速檢測L.monocytogenes的初步研究。

實現(xiàn)快速、特異地檢測食品中的L.monocytogenes，選擇合適的靶基因、設(shè)計合適的引物是關(guān)鍵。根據(jù)文獻(xiàn)報道，目前在L.monocytogenes的熒光定量PCR檢測中，選擇的靶基因和引物各不相同[2-7]。而hly基因為L.monocytogenes所特有，且在不同菌株之間具有較高的保守性，由其編碼的李斯特菌溶血素（LLO）被認(rèn)為是李斯特菌主要的致病因子[8-9]。因此，本研究選擇hly基因作為熒光定量PCR反應(yīng)的靶基因。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載多條不同來源的hly基因序列，用軟件DNAMAN進(jìn)行比對，找出相似片段，根據(jù)相似片段進(jìn)行兼并引物的設(shè)計。在相關(guān)文獻(xiàn)報道中，兼并引物的使用比較鮮見，而本研究設(shè)計的兼并引物可對不同來源的L.monocytogenes進(jìn)行檢測，擴(kuò)大食品中L.monocytogenes的檢測范圍，可作為通用引物。

本研究利用所設(shè)計的引物定量PCR擴(kuò)增5株L.monocytogenes，均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。而同時定量擴(kuò)增其他15株非L.monocytogenes有5株細(xì)菌在35個循環(huán)之后產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，其余10株均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，通過其熔解曲線可知，產(chǎn)生擴(kuò)增曲線的5株細(xì)菌在80～90℃沒有生成特異性熔解峰，說明建立的熒光定量PCR方法具有較好的特異性。但是對于部分細(xì)菌溶解曲線出現(xiàn)的小峰，相關(guān)資料表明可能是由于引物二聚體的存在造成的結(jié)果。所以近一步優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)的條件，減少非特異性擴(kuò)增，降低引物二聚體造成的不良影響尤其重要，作者接下來將針對這一問題進(jìn)行近一步研究。上述建立的熒光定量PCR方法也具有較高的靈敏度，可檢測到7.69×10copies/μL的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在人工污染鮮切甜瓜樣品的檢測中，最低檢出限為3.11×10cfu/mL。

本研究建立的熒光定量PCR檢測方法實現(xiàn)了在人工污染鮮切甜瓜樣品中的初步應(yīng)用，為保障鮮切果蔬的食品安全奠定了基礎(chǔ)。即使目前大規(guī)模爆發(fā)果蔬類食品污染L.monocytogenes而導(dǎo)致人類患病的報道為數(shù)不多，但個別L.monocytogenes中毒事件屢見不鮮，所以仍應(yīng)該提高重視，盡快研究出更快、更有效的檢測方法，實現(xiàn)防患于未然。

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Establishment and preliminary application of real-time fluorogenic quantitative PCR assay to rapid detection of Listeria monocytogenes

GUAN Di-kai1，2，HU Wen-zhong2，*，PIAO Yong-zhe2，CHEN Chen2，JIANG Ai-li2，WANG Yun-zhao2
（1.College of Food，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

Hly gene of Listeria monocytogenes was using as the target gene，a pair of degenerate primers were designed with Primer 5.0 ， and the method of real-time fluorogenic quantitative PCR assay to detection of Listeria monocytogenes was established.The specificity and sensitivity of plasmid standard and different strains were verified，its preliminary application in Artificial inoculation fresh-cut melon was realized.The results showed that the method had good specificity and sensitivity，and sensitivity for plasmid standard was 7.69 × 10copies/μL，the minimum detection limit of artificial inoculation fresh-cut melon was 3.11×10cfu/mL.

Listeria monocytogenes；real-time fluorogenic quantitative PCR；hly；fresh-cut melon

TS07

A

1002-0306（2014）20-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.001

2014－05-12

關(guān)棣鍇（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

* 通訊作者：胡文忠（1959-），男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)。

國家自然科學(xué)基金項目（31172009，31340038）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）；大連市科技計劃項目（2012E13SF106）；大連市金州新區(qū)科技計劃項目（2012-A1-049）。