詹先強 俞建萍 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

雞腹瀉常見病原菌的分離與鑒定

詹先強 俞建萍 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

為了深入了解當前雞腹瀉常見病原菌的種類及毒力等，本研究通過采集腹瀉患雞的病料，分別用細菌分離培養(yǎng)法、染色鏡檢法、動物試驗和血清學(xué)方法進行分離與鑒定。試驗結(jié)果表明：5株為雞大腸桿菌、3株為肺炎雙球菌、2株為鏈球菌、1株為雞沙門氏菌，其中大腸桿菌、鏈球菌和肺炎雙球菌均可使動物發(fā)病率高達100%。同時試驗結(jié)果提示：50%（4/8）為混合感染，其余為單獨感染?？傊壳耙痣u腹瀉的主要病原菌為大腸桿菌、肺炎雙球菌、鏈球菌、沙門氏菌等。本研究為養(yǎng)禽業(yè)有關(guān)雞腹瀉的正確診斷提供可靠依據(jù)，對該病的有效防控具有重要的理論指導(dǎo)意義和經(jīng)濟實用價值。

雞腹瀉 病原菌 分離 鑒定

近年來，隨著養(yǎng)禽業(yè)的不斷發(fā)展，雞腹瀉廣泛發(fā)生于全國各地養(yǎng)禽場，并已然成為疾病防治中的一項重點研究對象。雞腹瀉是由多種病因引起的以排稀糞或水樣糞便為特點的多種疾病的總稱。生產(chǎn)實踐證明，引起雞腹瀉的病原菌有多種［1-6］：雞白痢沙門氏菌、雞傷寒菌和副傷寒菌、大腸桿菌、鏈球菌、李氏桿菌、耶氏菌等。由于病因復(fù)雜，常給該病的防治帶來許多困難。為更好地了解該病的常見致病菌，為該病的防治提供可靠的條件和依據(jù)，從而指導(dǎo)和運用于養(yǎng)雞生產(chǎn)以減少該病帶來的經(jīng)濟損失，為此，筆者從福建省某發(fā)病雞場隨機抽檢腹瀉患雞，對其臨床觀察和剖檢的基礎(chǔ)上，適當采集病料進行細菌學(xué)檢測。

1 材料與方法

1.1 病料來源及有關(guān)情況 從福建省某發(fā)病雞場隨機抽取485日齡腹瀉烏雞8羽，均按正常標準飼養(yǎng)管理?；茧u消瘦，產(chǎn)蛋率下降，僅為正常的32%。其中有3羽雞排綠色、白綠色或糖稀狀糞便。對其進行解剖，發(fā)現(xiàn)有2羽雞心臟顏色暗紅，4羽雞肝邊緣出血，2羽雞腎腫大，2羽雞肺壞死。無菌操作采取病料心、肝、脾、肺、腎及小腸、大腸黏膜表面刮取物以備檢驗。

1.2 培養(yǎng)基 1%葡萄糖肉湯按常規(guī)方法［7］配制；麥康凱瓊脂、改良馬丁培養(yǎng)基由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技公司生產(chǎn)，以上培養(yǎng)基均按說明書配制使用；綿羊血平板培養(yǎng)基由本公司制備。

1.3 試驗動物

1.3 .1 動物來源及飼養(yǎng)管理 ICR小鼠20只，體重18～20 g/只，雌雄各半，購自福州海王福藥制藥有限公司。按正常標準飼養(yǎng)管理觀察3 d，均正?；顫?。

1.3 .2 動物分組 將小鼠隨機分為4個組，每組5只，其中3個試驗組和1個對照組。

1.4 診斷血清及抗原 23種大腸桿菌O因子血清購自中國獸藥監(jiān)察所細菌室，型號分別為：O1、O2、O4、O5、O11、O15、O20、O21、O22、O23、O25、O26、O35、O53、O54、O68、O78、O109、O111、O119、O147、O148、O157，均在有效期內(nèi)。雞白痢-雞傷寒多價平板凝集抗原購自北京中海動物保健科技公司。

2 試驗方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)染色鏡檢及純培養(yǎng)

2.1.1 細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢 無菌采取病料分別接種于1%葡萄糖肉湯，置37℃培養(yǎng)24 h，然后從中勾菌分別在SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上進行劃線分離，置37℃培養(yǎng)24 h，觀察分離菌菌落生長性狀。選定可疑菌落分別劃線于綿羊血平板上，置37℃培養(yǎng)48 h，分別觀察細菌溶血現(xiàn)象。用分離到的可疑典型菌落分別抹片，進行革蘭氏染色，油鏡觀察細菌形態(tài)。分離菌株編號與病料編號一致。

2.1 .2 增菌純培養(yǎng) 選定單個可疑典型菌落，無菌操作分別接種于1%葡萄糖肉湯或改良馬丁培養(yǎng)基，置37℃、24 h進行純培養(yǎng)。

2.2 動物致病性試驗 將已選定的可疑分離菌株肉湯純培養(yǎng)物分別接種試驗組小白鼠，每組（5只）接種1種分離菌，每只腹腔注射0.2 mL，對照組接種等量的肉湯培養(yǎng)基。注射后連同對照組連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病情況。第7 d對所有的小白鼠進行剖解，觀察病變，取其病料，抹片染色鏡檢，并分離培養(yǎng)，回收接種菌。

2.3 細菌血清學(xué)鑒定

2.3 .1 菌體O抗原的制備 分別將可疑分離菌株在普通瓊脂平板上37℃、24 h進行培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物用少量0.5%石炭酸生理鹽水沖洗，并分別收集于青霉素瓶中，包裝后置121℃加熱處理100 min。

2.3 .2 O因子血清平板凝集試驗 用微量加樣器分別吸取各種O因子血清50 uL置于潔凈微量反應(yīng)板上，然后再吸取已制備的菌體抗原進行混勻。若細菌抗原與相應(yīng)血清作用，則3 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時分離菌抗原需作抗原對照，應(yīng)均無自凝現(xiàn)象。

3 結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果見表1。

表1 細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢

3.2 動物致病性試驗 接種后2 h，15只小白鼠全部發(fā)病，扎堆、炸毛、精神沉郁、呼吸急促。連續(xù)觀察7 d，所有試驗組菌株均未使小白鼠死亡，對照組均正常。但攻毒前后對照組體重增幅明顯高于試驗組。對試驗組所有小白鼠進行解剖觀察，雞大腸桿菌組有3只鼠腸道有大量氣泡、黃色內(nèi)容物，1只鼠肝表面有較多出血點、質(zhì)地較脆，1只鼠脾臟色澤較淺；攻雞鏈球菌組有3只鼠肝邊緣稍發(fā)白，2只鼠肝表面有少量出血；攻雞肺炎雙球菌組有2只鼠肺發(fā)白，并且其中1只肺壞死，另有1只心腫大，1只有心包炎。對照組小白鼠經(jīng)剖檢無病變出現(xiàn)。剖檢鏡檢觀察從其肝臟中分別分離出的菌株形態(tài)與攻毒菌一致。發(fā)病情況統(tǒng)計結(jié)果見表2。

3.3 血清學(xué)鑒定結(jié)果 結(jié)果見表3。

大腸桿菌O因子血清凝集試驗分離的5株雞大腸桿菌均與雞大腸桿菌O119因子血清發(fā)生快速凝集，強陽性，因此，可確定5個菌株血清型均為O119。

表2 分離菌動物致病性試驗結(jié)果

表3 分離菌血清學(xué)鑒定結(jié)果

4 小結(jié)與討論

4.1 小結(jié) 雞腹瀉主要病原性細菌為O119雞大腸桿菌，其次為肺炎雙球菌、雞鏈球菌、雞沙門氏菌等。

4.2 討論

1）對細菌進行抹片染色、鏡檢、分離培養(yǎng)、動物致病性試驗、O因子血清凝集試驗鑒定，結(jié)果證實雞腹瀉主要由病原性細菌引起，其中5株O119型雞大腸桿菌、3株肺炎雙球菌、2株鏈球菌、1株雞沙門氏菌。對于導(dǎo)致雞腹瀉的研究國內(nèi)外已有許多報道，但對于烏雞腹瀉病原菌的混合感染研究報道極少，故本研究可為烏雞腹瀉的正確診斷提供重要依據(jù)。

2）動物致病性試驗結(jié)果表明：雞大腸桿菌、肺炎雙球菌和鏈球菌接種試驗動物均可導(dǎo)致發(fā)病。腸致死性大腸桿菌在十二指腸、空腸和回腸黏膜表面大量繁殖，黏附于微絨毛，導(dǎo)致刷狀緣被破壞，微絨毛斷裂，上皮細胞排列紊亂和功能受損，造成嚴重腹瀉［7-8］。禽鏈球菌病又稱鏈球菌性敗血癥，是禽類的一種急性、敗血性傳染病，該病菌自1979年起有雛雞鏈球菌病的報道［9］，該病在世界許多國家都有發(fā)生，多呈地方性流行，也常呈散發(fā)，嚴重時呈毀滅性流行。而肺炎雙球菌會引起肺腫大、呼吸急促。多種病菌引起的雞腹瀉使養(yǎng)殖戶受到經(jīng)濟損失。目前從臨床發(fā)病的烏雞來看，致病力相對較弱，主要表現(xiàn)為排稀便、精神不振、食欲下降，但菌株毒力不是很強，無死亡發(fā)生。但由于患雞長期發(fā)生腹瀉，造成的經(jīng)濟損失巨大，因此，應(yīng)引起高度重視。

3）O因子血清鑒定結(jié)果表明，發(fā)病雞場大腸桿菌的主要血清型為O119型，與參考文獻報道基本吻合［10］。故建議各地在進行雞大腸桿菌病的免疫預(yù)防時，所選疫苗的血清型一定要與當?shù)亓餍芯晗辔呛?，最好選用當?shù)胤蛛x株的自家菌苗，這樣才能有效預(yù)防該病，否則會導(dǎo)致免疫效果不良或失敗，給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

4）本試驗從病料中分離出了1株沙門氏菌，由于時間和條件所限，目前未能確定其血清型。有關(guān)其血清型和更多的生化試驗內(nèi)容均有待進一步深入研究。

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