嚴(yán)明錦，陳若霖，樸豐源

(1.解放軍第210 醫(yī)院 護理部，遼寧 大連116021;2.大連醫(yī)科大學(xué) 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，遼寧 大連116044)

正己烷作為有機溶劑，廣泛應(yīng)用于機械清洗、工業(yè)粘膠配制及電器制造等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域。由于正己烷易于揮發(fā)，當(dāng)人們長期暴露于正己烷時，可導(dǎo)致以感覺運動型多發(fā)性周圍神經(jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒［1］。代謝研究表明，2，5 -己二酮(2，5 -HD)是正己烷體內(nèi)代謝產(chǎn)物，是誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的終毒物［2］。文獻(xiàn)報道，2，5 -HD 可誘導(dǎo)多種組織細(xì)胞的凋亡。然而其誘導(dǎo)機制尚不清楚。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類具有自我更新分化能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。目前已成為組織和器官修復(fù)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。近年來，把MSCs 作為一種新的體外細(xì)胞模型來研究細(xì)胞毒性，引起廣泛關(guān)注。一些文獻(xiàn)已經(jīng)報道，鉛、砷等外源化合物可誘導(dǎo)MSCs 凋亡［3-4］。但有關(guān)2，5 - HD 暴露對MSCs 凋亡影響的研究，尚未見報道。本文用2，5 -HD 作為受試物，大鼠骨髓MSCs(BMSCs)作為體外細(xì)胞模型，就2，5 -HD 對BMSCs 的凋亡作用及其作用機制進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

(1)SD 大鼠BMSCs:取4 ～6 周齡SD 大鼠股骨骨髓，體外培養(yǎng)及純化獲得;(2)主要試劑:L -DMEM 培養(yǎng)基(Gibco BRL 公司);胎牛血清(NQBB公司);胰酶(sigma 公司);SD 大鼠BMSCs 成脂誘分化培養(yǎng)基、SD 大鼠BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)公司);流式FITC-CD29 抗體、PE-CD45 抗體、PE-CD90 抗體(e -BIOSCIENCE 公司);HE 染色試劑盒(中杉金橋);hoechst 33342(sigma 公司);兔抗大鼠Bax，Bcl -2 一抗(CST 公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋);辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋);IX -70 型倒置顯微鏡(Olympus公司);MCO-15AC 型CO2 孵育箱(SANYO 公司);流式細(xì)胞儀(BD 公司)。

1.2 方 法

1.2.1 BMSCs 的提取及原代培養(yǎng):選用4 ～6 周齡健康SD 大鼠，脫臼處死，無菌分離股骨、脛骨，清除附著的肌肉組織，暴露骨髓腔并用PBS 反復(fù)沖洗，收集骨髓細(xì)胞，200 目銅網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，用含12%胎牛血清LG -DMEM 重懸細(xì)胞，以接種細(xì)胞于塑料平皿中，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，并標(biāo)記為原代(P0)。72 h 首次換液，以后每3 d 換液1 次，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)特征。

1.2.2 BMSCs 傳代培養(yǎng):原代細(xì)胞80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3 比例傳代培養(yǎng)，直到貼壁細(xì)胞接近融合，再重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代擴增，并標(biāo)記為P1～P5代等。

1.2.3 BMSCs 的鑒定:流式細(xì)胞儀檢測大鼠BMSCs 表面抗體陽性標(biāo)志物CD29 為90.10%和CD90為96.61%，陰性標(biāo)記物CD45 為0.40%。所提取細(xì)胞可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。提示，這些細(xì)胞為大鼠BMSCs(此部分結(jié)果未在本文中顯示)。

1.2.4 實驗分組:將大鼠BMSCs 分為4 組，即10 mmol/L、20 mmol/L 和40 mmol/L 2，5 -HD 染毒組及只給treat 液的對照組(含2% 血清的LG -DMEM)，培養(yǎng)24 h。

1.2. 5 細(xì)胞活性檢測:取培養(yǎng)至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接種于24 孔板中，每組設(shè)3 復(fù)孔。染毒24 h 后去除原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗3次。加入含12%血清L - DMEM 500 μL/孔，加入MTT 50 μL/孔。置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。輕輕吸棄原培養(yǎng)液，加入750 μL/孔的DMSO，37 ℃反應(yīng)10 min，吸取此培養(yǎng)液，加入96 孔板中，每孔100 μL。每組設(shè)3 復(fù)孔，酶標(biāo)儀測定492 nm 吸光度值。

1.2.6 HE 染色:取培養(yǎng)至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接種于24 孔板中，染毒24 h后去除原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗3 次，加蘇木精染色5 min，去除蘇木精，PBS 沖洗3 次。加伊紅5 min，去除伊紅，PBS 沖洗3 次。倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.7 hoechst 染色:取培養(yǎng)至P4代BMSCs，0.25%胰蛋白酶消化后，接種于24 孔板中，染毒24 h 后去除原培養(yǎng)液，用PBS 沖洗3 次。將帶有Hoechst 染料的treat 液(終濃度為10 μg/mL)，加入到24 孔板中，37 ℃避光反應(yīng)20 min。熒光顯微鏡下觀察，紫光激發(fā)。

1.2.8 Western Blot 分析:采用BCA 比色法試劑盒測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，將30 μg 總蛋白加入4 Loading buffer，95 ℃煮沸5 min 后，經(jīng)15%分離膠行SDS-PAGE 電泳，并以預(yù)染蛋白maker 為標(biāo)志，判定電泳終止時間。60 V 恒壓將樣品轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜上，時間為2 h;于5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h;TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加入1∶500小鼠抗大鼠β - actin(或1 ∶400 兔抗大鼠Bax，或1∶400兔抗大鼠Bcl -2 單克隆抗體)，4 ℃孵育過夜;TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加入1∶5 000 辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(或1∶4 000 辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體)，37 ℃孵育2 h;TBS -T 洗膜3次，每次10 min;ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0 進行One - Way ANVOA 分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs 的培養(yǎng)

BMSCs 初始分離時，大小不一，多數(shù)呈圓形或橢圓形，72 h 后部分細(xì)胞貼壁，呈短梭形、多角形等多種形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合至80% ～90% 后傳代(圖1A)。細(xì)胞傳代后生長速度明顯加快，24 h 后基本完全貼壁，第3 代后細(xì)胞基本為多角形、梭形，形態(tài)均一，呈漩渦狀或簇狀排列(圖1B)

圖1 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察Fig 1 MorphologyofBMSCs

2.2 2，5 -HD 對BMSCs 活力影響

各實驗組BMSCs 存活率顯著低于對照組(P ＜0.05)，且其存活率隨著2，5 -HD 濃度的升高而下降(圖2)。

2.3 HE 染色觀察

HE 染色結(jié)果顯示，對照組BMSCs 呈梭形或多邊形，并有較長的神經(jīng)突起;各實驗組BMSCs 變圓，部分細(xì)胞皺縮，胞體變小，胞核固縮，貼壁能力減弱，且隨2，5 -HD 濃度的增大，這種細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯(圖3)。

圖2 2，5 -HD 暴露BMSCs 活力Fig 2 Viability of BMSCs exposed to 2，5 -HD

圖3 2，5 -HD 暴露BMSCs 的形態(tài)學(xué)變化(HE 染色×100)Fig 3 Morphologic changes of BMSCs exposed to HD (HE staining×100)

2.4 Hoechst 染色觀察

在熒光顯微鏡下經(jīng)紫外激發(fā)，可見正常細(xì)胞的核呈均勻的藍(lán)色熒光;而在各實驗組，部分BMSCs可見細(xì)胞核呈現(xiàn)核固縮和新月形等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變(如圖4箭頭所示)，且隨2，5 -HD 濃度的升高具有這種特征的細(xì)胞增多(圖4)。

圖4 2，5 -HD 暴露BMSCs 的凋亡特征性形態(tài)變化(Hoechst 染色×200)Fig 4 Morphologic changes of apoptotic BMSCs(Hoechststaining×200)

2.5 2，5 -HD 對BMSCs Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)影響

檢測結(jié)果表明，2，5 -HD 染毒BMSCs 的Bax 蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P ＜0.05)，且隨染毒劑量的增加而升高，呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系(圖5A)。而染毒組BMSCs 的Bcl-2 蛋白表達(dá)水平則顯著低于對照組(P ＜0. 05)(圖5B)。染毒組BMSCs 的Bax 與Bcl -2 的蛋白表達(dá)比值顯著高于對照組(P ＜0.05)(圖5C)。

圖5 5 -HD 暴露BMSCs 的Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig 5 Expression of Bax and Bcl-2 proteins in BMSCs exposed to HD

3 討 論

一些研究提示，2，5 - HD 可誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡［5-6］。本研究結(jié)果顯示，2，5 - HD 暴露導(dǎo)致了BMSCs 活力顯著下降，呈現(xiàn)核固縮和新月形等典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變的BMSCs 增多，與上述文獻(xiàn)報道一致。這些結(jié)果提示，2，5 -HD 暴露誘導(dǎo)BMSCs凋亡。

細(xì)胞凋亡是由于細(xì)胞受內(nèi)外因素刺激，觸發(fā)其本身的死亡程序而導(dǎo)致的，一種主動且由凋亡相關(guān)蛋白嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞自我消亡過程［7］。Bax 和Bcl-2是已發(fā)現(xiàn)的重要凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白。Bax 發(fā)揮促凋亡作用，而Bcl -2 發(fā)揮抗凋亡作用，二者作用的調(diào)控整合決定細(xì)胞的生死［8-9］。本研究結(jié)果顯示，2，5 -HD 染毒BMSCs 的Bax 蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，而Bcl-2 蛋白表達(dá)水平則顯著低于對照組，且Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)比值呈現(xiàn)劑量依賴性升高。Sun Y 等［5］和Ogawa 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，2，5 -HD 誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞Bax 表達(dá)上調(diào)和Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，與本研究結(jié)果一致。這些結(jié)果提示，2，5 - HD 暴露誘導(dǎo)BMSCs 凋亡可能與Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)紊亂有關(guān)。今后有必要對2，5 -HD 暴露BMSCs 凋亡通路下游調(diào)控蛋白的表達(dá)變化，進行進一步研究。

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