李程程

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000）

蔬菜中亞硝酸鹽提取及測(cè)定條件的優(yōu)化

李程程

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000）

文章優(yōu)化了亞硝酸鹽提取和測(cè)定的最佳條件，采用重氮化偶合法對(duì)蔬菜中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，最佳提取溫度為70 ℃，最佳提取時(shí)間為45 min，顯色時(shí)間為15 min。該方案的線性范圍為0～0.3 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 168，回收率為94.6%～104%的亞硝酸鈉含量。

亞硝酸鹽；優(yōu)化；提??；測(cè)定

近幾年來我國人口中患消化系統(tǒng)癌癥的人數(shù)明顯增多，根據(jù)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，造成這種現(xiàn)象的原因與我國人口攝入過多的硝酸鹽和亞硝酸鹽是分不開的。[1]工業(yè)、農(nóng)業(yè)的發(fā)展導(dǎo)致了地區(qū)和全球氮循環(huán)的混亂，亞硝酸鹽的滲透還引起地下水污染，威脅著人類的健康。[2]尤其是化學(xué)氮肥的廣泛使用，使得蔬菜中的硝酸鹽及亞硝酸鹽殘留量過高。

人體持續(xù)攝入少量的硝酸鹽會(huì)引起消化不良、精神抑郁和頭痛等癥狀，攝入0.3～0.5 g亞硝酸鹽可引起中毒，攝入3 g亞硝酸鹽可致死。另外亞硝酸鹽能夠透過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，人體血液中亞硝酸鈉濃度為 0.4～200 mg/kg時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性,孕婦食用過量的亞硝酸鈉可導(dǎo)致胎兒畸形，特別是6個(gè)月以內(nèi)的嬰兒[2]。

本文以傳統(tǒng)的重氮化偶合法為基礎(chǔ)，利用重氮化偶合法，對(duì)常見的蔬菜在不同的貯存條件下，亞硝酸鹽的含量及轉(zhuǎn)化關(guān)系作對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過改進(jìn)樣品預(yù)處理的方法，消除了抗壞血酸帶來的干擾，提高了對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的精確度，總結(jié)出它們的變化規(guī)律，從而為人類在日常生活中如何選擇蔬菜、如何科學(xué)食用和貯存蔬菜提供科學(xué)的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

菠菜：購于文山當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。

1.1.2 試劑

飽和硼砂溶液（Na2B4O7·10H2O）、亞鐵氰化鉀溶液（150 g/L）、硫酸鋅溶液（1 mol/L）、鹽酸溶液（200 g/L）、對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 g/L）、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 g/L）。

1.1.3 儀器、設(shè)備

JYL-C012料理機(jī)（九陽公司）、V-1100D型可見分光光度計(jì)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）、XS225A電子天平（Precisc Gravimetrics AG/Switzer-Cand）、常用實(shí)驗(yàn)玻璃儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

將蔬菜用去離子水洗凈，晾干，取可食用部份切碎混勻。用四分法取適量切碎的樣品，用研缽制成勻漿備用。

1.2.2 亞硝酸鹽提取

1.2.2.1 提取溫度的選擇

稱4.00 g制成勻漿的試樣，置于50 mL的燒杯中，加10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加水50 mL，提取時(shí)間定為45 min，分別在 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃條件下進(jìn)行提取。

1.2.2.2 提取時(shí)間的選擇

稱4.00 g制成勻漿的試樣，置于50 mL的燒杯中，加10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，加水50 mL，提取溫度定為70 ℃，分別提取15 min、25 min、35 min、45 min、50 min。

1.2.3 提取液凈化

稱4.00 g試樣，置于50 mL的燒杯中，加10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以70 ℃的水50 mL，將試樣洗入100 mL容量瓶，于70 ℃中加熱45 min，取出至冷水浴中冷卻，并放置至室溫。在震蕩上述提取液時(shí)，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，加入5 mL乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)，再加入1 g活性炭脫色除去抗壞血酸。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[3]

取0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 ug/mL），分別置于50 mL帶塞比色管中。標(biāo)準(zhǔn)管中分別加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3～5 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長538 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品中抗壞面酸影響的消作

新鮮蔬菜中含有一定量的抗壞血酸，而抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽的測(cè)定具有一定的影響。[4]因此采用添加活性炭的方法消除抗壞血酸的影響。

用四分法取適量切碎的樣品，用研缽制成勻漿備用。稱4.00 g制成勻漿的試樣，置于50 mL的燒杯中，加10 mL飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以70 ℃的水50 mL，將試樣洗入100 mL容量瓶，于70 ℃中加熱45 min，取出至冷水浴中冷卻，并放置至室溫。在震蕩上述提取液時(shí)，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，加入5 mL乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)，再加入1 g活性炭脫色、除去抗壞血酸。加水定容至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上層清液用濾紙過濾，并棄去30 mL初濾液，濾液備用。吸取40 mL濾液于50 mL帶塞比色管中，試樣管中分別加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，放置3～5 min，加入1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用2 cm比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長538 nm處測(cè)吸光度。

1.2.6 計(jì)算公式

式中：w 為樣品中亞硝酸鹽的含量，ug/g；

m 為樣品質(zhì)量，g；

x 為測(cè)定用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，μg；

v1為樣品處理液總體積，mL；

v2為測(cè)定用樣液體積，mL。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，不同濃度亞硝酸鹽在538 nm處的吸光度是呈線性規(guī)律的，其線性方程是y=0.0304x-0.029，相關(guān)系數(shù)為0.9991。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 提取溫度的選擇

由圖2可以看出，在固定提取時(shí)間為45 min時(shí)，亞硝酸鹽含量在70 ℃時(shí)達(dá)到最高值，隨后隨著溫度的升高亞硝酸鹽含量逐漸下降，當(dāng)溫度為100 ℃時(shí)亞硝酸鹽的含量降到最低，因此提取溫度定為70 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

2.2.1 提取時(shí)間的選擇

由圖3可以看出，提取溫度定為70 ℃時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加亞硝酸鹽含量不斷增加，當(dāng)提取45 min時(shí)含量達(dá)到最大值，隨后下降。因此最終確定提取時(shí)間為45 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

2.2.2 顯色時(shí)間的選擇

分別用4分法稱取4.00 g樣品，采用重氮化偶合法處理后進(jìn)行測(cè)定，得到如下結(jié)果：

圖4 顯色時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

由圖4可以看出，相同條件下處理的試樣，顯色時(shí)間在15 min時(shí)亞硝酸鹽含量最高，之后隨著顯色時(shí)間的延長，亞硝酸鹽的吸光度變小，在30 min時(shí)有明顯的下降趨勢(shì)，因此確定顯色時(shí)間為15 min。

2.3 活性炭對(duì)樣品中抗壞血酸干擾的影響

由表1可以看出同樣的條件下，測(cè)得的亞硝酸鹽含量加入活性炭的樣品中測(cè)出的亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未加入活性炭的樣品中的亞硝酸鹽含量，說明加入活性炭處理的樣品已經(jīng)消除了抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定的干擾，使得亞硝酸鹽測(cè)定的數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。因此，樣品處理時(shí)加入活性炭能使亞硝酸鹽更好地提取出來。

表1 活性炭對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

2.4 精密度及回收率

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

稱取4.00 g制成勻漿的試樣6份，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行提取和測(cè)定，考察方法的精密度，得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 168，表明本方法重現(xiàn)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)方法的精密度

2.4.2 回收率

以新鮮蔬菜樣品作為本底，加入3個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3，亞硝酸鹽的回收率較高，為94.6%～101.4%。

表3 重氧化偶合提取法中亞硝酸鹽的回收率

3 結(jié)論

通過研究設(shè)計(jì)出一套合理可行的分光光度法測(cè)定蔬菜中亞硝酸鹽的方案，最終確定了蔬菜中亞硝酸鹽提取的最優(yōu)條件及含量測(cè)定的最佳條件。分別為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間45 min，顯色時(shí)間15 min。在此條件下測(cè)定的亞硝酸鹽含量最高，針對(duì)亞硝酸鹽的測(cè)定，該方案的線性范圍為0～0.3 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9991，檢出限為0.14 mg/kg，便于對(duì)日常使用蔬菜中亞硝酸鹽含量的監(jiān)測(cè)的回收率為94.61%～104%。通過正確的蔬菜處理方法，平時(shí)少食用亞硝酸鹽含量高的葉菜類蔬菜，如香菜、芥菜、芹菜等，多吃一些根莖類和瓜果類蔬菜。也可以將蔬菜浸泡10 min左右，煮沸時(shí)間要控制在5～10 min以內(nèi)，減少煮熟蔬菜的放置時(shí)間，隔夜菜不食用等方面可減少亞硝酸鹽的攝入量。

［1］ 劉宗林，賈建會(huì).蔬菜中硝酸鹽的危害及檢測(cè)[J].食品科學(xué)，2001（7）：65-67.

［2］ 郭寶珍，李玉蘭．防患于未然——亞硝酸鹽對(duì)人體的危害[J].中學(xué)生物教學(xué)，2003（1-2）：58.

［3］ GB/T1540/—94．水果、蔬菜及其制品亞硝酸鹽和硝酸鹽含量[S]．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.

［4］ 周文斌.包菜中亞硝酸鹽測(cè)定方法研究[J].食品科學(xué), 2006（2）：241-243.

Extraction of Nitrite in Vegetables and Optimization of Determination Condition

LI Cheng-cheng
(College of Bio-Chemistry, Wenshan University, Wenshan 663000, China）

In this paper, the best condition of extraction and determination is optimized. Determination of nitrite in vegetables is made by diazotization coupling. The results show that: the optimal extraction temperature is 70℃, the best extraction time is 45 min, chromogenic time is 15 min. The linear range is 0～0.3 mg/L, the linear correlation coefficient r=0.999, the standard deviation is 0.012168, the recovery rate of nitrite content is 94.6%～104%.

Nitrite; optimization; extaction; determination

TS255.7

A

1674-9200（2014）06-0014-04

（責(zé)任編輯 張鐵 ）

2014-09-10

李程程（1985-），女，吉林遼源人，文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院助教，碩士，主要從事食品化學(xué)，食品微生物的研究。