楊蕊珂，楊麗紅，王淑輝，喬鵬，徐金義，李涵，張強

基礎與實驗研究

微小核糖核酸-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調控*

楊蕊珂，楊麗紅，王淑輝，喬鵬，徐金義，李涵，張強

目的: 探討微小核糖核酸-34（amiRNA-34a）對左心室肥厚大鼠心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調控及其意義。

心肌肥厚; 微小核糖核酸-34a; 肌球蛋白重鏈α

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:138.)

心肌肥厚是心肌對長期壓力超負荷、內分泌激活、能量代謝障礙等刺激因素的代償表現(xiàn)。肥厚心肌結構功能的改變與肌球蛋白“胚胎化” 密切相關，即肌球蛋白重鏈α基因表達下調，肌球蛋白重鏈β基因表達上調，這一過程受多種微小核糖核酸（miRNA）調控[1]。通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站，美國國家生物技術信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫查找結果顯示，肌球蛋白重鏈α基因表達可能受miRNA-34a調控，本研究通過腹主動脈縮窄術建立左心室肥厚大鼠模型，探討miRNA-34a對大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調控作用，以及對肥厚心肌組織結構及功能的影響。

1 材料與方法

阻遏物及其陰性對照物： miRNA-34a表達阻遏物經鎖核酸修飾的可皮下釋放的改良寡聚核苷酸（LNA-antimiRNA-34a）[2]，miRNA-34a序列打亂后形成的陰性對照物（LNA-contrl-34a）, 均購自上海生工生物有限公司。

動物模型建立及分組：2013-02由鄭州大學動物實驗中心提供健康12周齡雄性SD大鼠40只，體重250～320 g。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組，每組10只。分別為腹主動脈縮窄術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/AAC組），腹主動脈縮窄術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/AAC組），假手術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/SH組），假手術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/SH組）。ant-34a/AAC組和con/AAC組行腹主動脈縮窄術建立左心室肥厚大鼠模型[3]：以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后開腹，分離腹主動脈，在右腎動脈上方腹主動脈處用5～0縫線將其與外徑為0.6 mm的注射器針頭一并扎緊，迅速將針頭移去，逐層縫合關腹；ant-34a/SH組和con/SH組穿線不結扎，其他手術處理與前兩組相同。4組大鼠術后均給予青霉素5000 U/只,肌肉注射1周，預防感染。各組分籠飼養(yǎng)5周后從第6周開始每周1、3、5，ant-34a/AAC組和ant-34a/SH組分別皮下注射25 mg/kg LNA-antimiR-34a，con/AAC組和con/SH組分別皮下注射25 mg/ kg LNA-contrl-34a，連續(xù)注射6周[4]。第12周存活大鼠：ant-34a/AAC組6只，con/AAC組7只，ant-34a/SH組8只，con/SH組8只。

血流動力學參數(shù)及心肌肥厚指數(shù)測定：大鼠稱重后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經頸動脈插管至左心室，用PowerLab/4SP型生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄左心室收縮壓,左心室舒張末期壓以及壓力最大變化速率；檢測完畢后，開胸迅速取出心臟，置入冰生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱取全心重量，取左心室及室間隔稱重，并計算心肌肥厚指數(shù)：心重指數(shù)=全心重量（mg）/體重（g），左心指數(shù)=左心室重量（mg）/體重（g）。將左心室心肌組織分為兩部分，一部分放入無菌凍存管中并置于液氮罐中，然后轉移至-80℃冰箱保存；另一部分放置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出，常規(guī)石蠟包埋備用。

心肌組織病理學觀察：各組大鼠心肌組織蠟塊切片，蘇木素伊紅染色，在光鏡（×200）下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

心肌組織miRNA-34a，肌球蛋白重鏈α基因表達的測定：Trizol法提取總RNA,使用Applied Biosystems 7300型PCR基因擴增儀進行熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應 (qRT-PCR)， miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因相對表達倍數(shù)按2-△△Ct計算。引物序列見表1。

表1 引物序列表

統(tǒng)計學處理：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組計量資料間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組血流動力學參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRTPCR結果比較：與con/AAC組相比， ant-34a/AAC組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低，壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（P均＜0.05）。與con/AAC組相比，con/SH組心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低,壓力最大上升和下降速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 （P均＜0.05）。與con/SH組相比， ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低，肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高 （P均＜0.05），心重指數(shù)、左心指數(shù)、左心室收縮壓、左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表2

心肌組織病理學觀察：ant-34a/SH組（圖1C）和con/SH組（圖1D）心肌細胞排列整齊，大小正常，胞漿均勻，胞核染色均勻，胞外基質膠原沉淀少，無炎癥細胞浸潤；con/AAC組（圖1B）大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞明顯肥大增寬,細胞漿濃染，細胞間距增大,胞外較多膠質沉積。ant-34a/AAC組（圖1A）病理學表現(xiàn)介于兩個SH組與con/AAC組之間。

表2 各組血流動力學參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結果比較

表2 各組血流動力學參數(shù)、心肌肥厚指數(shù)及qRT-PCR 結果比較

注：與con/AAC組比*P＜0.05，與con/SH組比△P＜0.05。ant-34a/AAC組：腹主動脈縮窄術后皮下注射miR-34a表達阻遏物組；con/AAC組：腹主動脈縮窄術后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組；ant-34a/SH組：假手術后皮下注射miR-34a表達阻遏物組；con/SH組：假手術后皮下注射miR-34a表達阻遏物陰性對照物組；α-MHC：肌球蛋白重鏈α；qRT-PCR：熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應。1 mmHg=0.133 kPa。余注見表1

組別 con/AAC組 (n=7) ant-34a/AAC組 (n=6) con/SH組 (n=8) ant-34a/SH組 (n=8)血流動力學參數(shù)左心室收縮壓(mmHg) 145.93±6.83 138.36±5.73* 130.55±5.73* 128.96±7.45左心室舒張末期壓(mmHg) 6.63±0.32 5.67±0.36* 4.41±0.36* 4.49±0.36壓力最大上升速率(mmHg/s) 5681.04±92.19 6237.42±37.50* 6734.09±82.78* 6723.09±85.37壓力最大下降速率(mmHg/s) 4632.04±138.70 4938.84±105.46* 5221.86±145.11* 5256.45±125.43心肌肥厚指數(shù)體重 (g) 406.151±37.673 405.557±38.764 406.415±30.626 405.714±31.454心重指數(shù) (mg/g) 3.453±0.256 3.325±0.263* 3.012±0.124* 3.022±0.241左心指數(shù) (mg/g) 2.531±0.254 2.404±0.341* 2.134±0.213* 2.021±0.102 qRT-PCR結果miRNA-34a相對表達量 1.03±0.26 0.18±0.22* 0.49±0.17* 0.06±0.12△α-MHC基因相對表達量 0.81±0.21 1.13±0.37* 1.61±0.29* 1.74±0.36△

圖1 各組大鼠心肌組織病理學表現(xiàn)（×200）

3 討論

心肌肥厚表現(xiàn)為心肌細胞肥大、細胞外基質膠質沉積和纖維化等一系列病理生理變化。各種因素引起的心肌肥厚，均伴隨著肌球蛋白重鏈胚胎基因的激活和異常表達[5]。

肌球蛋白是心肌重要的收縮蛋白，主要由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，哺乳動物心肌肌球蛋白重鏈由肌球蛋白重鏈α和β基因編碼，其表達產物構成三種二聚體，即α-α同二聚體（V1型）、αβ-異二聚體（V2型）和β-β（V3型）同二聚體，三者的三磷酸腺苷酶活性及收縮活性依次降低。心肌肥厚發(fā)生的主要組織學和分子遺傳學基礎是心肌細胞肌球蛋白重鏈基因表達向“胚胎型”轉變[6]，即肌球蛋白重鏈α基因表達下調伴隨著肌球蛋白重鏈β基因表達上調，二聚體由V1型向V3型轉化，肌球蛋白三磷酸腺苷酶活性下降，心肌收縮功能降低。肌球蛋白重鏈α基因的表達對維持心肌正常的收縮功能起重要作用，近年來，通過靶向調節(jié)肌球蛋白重鏈α基因表達，逆轉或減慢心肌肥厚進程成為治療高血壓性心臟病、肥厚性心肌病、心力衰竭等的新熱點[7]。

miRNA是一類由內源基因編碼的15～22 bp的非編碼單鏈RNA分子，通過結合靶基因mRNA的3＇非編碼區(qū)而對其表達進行轉錄后表達調控[8]。目前，已經證實miRNA在心肌病理重塑、缺血后損傷修復等病理生理機制中具有重要作用[9-11]。經基因檢索發(fā)現(xiàn)，哺乳動物肌球蛋白重鏈α基因為miRNA-34a下游靶基因，Bernardo等[4]研究表明，阻斷miRNA-34家族在大鼠肥厚心肌中的表達，可能對心肌重構及功能減退有保護作用，本研究在其基礎上通過靶向阻斷miRNA-34a在心肌的表達，觀察其對肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達的調控作用。結果表明miRNA-34a在腹主動脈縮窄術后大鼠肥厚心肌中表達明顯上調，伴隨肌球蛋白重鏈α基因表達下降以及心肌收縮舒張功能的減退，通過兩組腹主動脈縮窄模型大鼠比較證明通過靶向阻斷miRNA-34a表達可上調肌球蛋白重鏈α基因表達，抑制心肌向“胚胎型”轉變，減慢心肌肥厚進程。

心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素，臨床流行病學資料顯示高血壓合并左心室肥厚使心血管疾病發(fā)生率明顯增加[12]?，F(xiàn)有的治療措施只是延緩而不是阻止和逆轉心肌肥厚進程，其最終轉歸都是不可逆的心臟泵衰竭[13]，而β受體阻滯劑、血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑等藥物往往存在電解質紊亂、肝腎功能損害、低血壓、加重心力衰竭等副作用[14]，隨著miRNA-34家族在心肌細胞生長[15]、心肌肥厚[16]、病理重構[17]等方面的調節(jié)作用，及其在活體容易被阻斷的特性被逐漸了解[18]，同時隨著反義寡核苷酸化學和反義治療技術的發(fā)展通過靶向阻斷miRNA-34a表達[19]，上調肌球蛋白重鏈α基因的表達，減緩或者逆轉心肌肥厚進程，改善心功能的治療潛能被看好[18-20]。

由于哺乳動物心室肌肌球蛋白異構體的分布與種屬、年齡等因素有關，有待進一步研究明確miRNA-34a在人體內對肌球蛋白重鏈α基因表達的調控機制,同時還需要大量研究明確反義治療可能存在的不良靶目標外作用，為進一步應用于臨床提供可靠依據(jù)。

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Regulation of MicroRNA-34a on Myosin Heavy Chain-α Expression in Rats With Left Ventricular Hypertrophic Tissue

YANG Rui-ke, YANG Li-hong, WANG Shu-hui, QIAO Peng, XU Jin-yi, LI Han, ZHANG Qiang.

Department of Cardiology, the Second Aff i liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450014), Henan, China Corresponding Author: ZHANG Qiang, Email: zq3397@163.com

Objective: To explore the regulation effect of microRNA-34a (miR-34a) on myosin heavy chain α (α-MHC) expression in rats of left ventricular hypertrophic tissue with overloaded pressure.Methods: The cardiac hypertrophy rats’ model was established by abdominal aortic constriction (AAC), and 40 SD rats were randomly divided into 4 groups. ①AAC rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/AAC) group, ②AAC rats with LNA-control-34a (con/AAC) group, and ③sham operation rats with LNA-anti-miR-34a (ant-34a/SH) group, ④con/ SH group. n=10 in each group. With 12 weeks treatment, the surviving conditions were as 6 in ant-34a/AAC group, 7 in con/AAC group, and 8 in ant-34a/SH group, 8 in con/SH group. The left ventricular systolic pressure (LVSP), left ventricular eud distolic pressure (LVEDP), the maximum changing rate of pressure (±LVdp/dt)max, heart weight index (HM/ BM) and cardiac index (LVM/BM) were calculated, the pathological changes of myocardial tissue was observed and the expressions of miR-34a and α-MHC in the left ventricular tissue were analyzed.Results: Compared with con/AAC group, the ant-34a/AAC group had decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P<0.05. Compared with con/AAC group, the con/SH group showed decreased HM/BM, LVSP, LVEDP and miR-34a expression, increased (±LVdp/dt)max and α-MHC expression, all P＜0.05. Compared with con/SH group, the ant-34a/SH group presented decreased miR-34a expression and increased α-MHC expression, both P<0.05; the HM/BM, LVSP, LVEDP and (±LVdp/dt)max were similar, all P>0.05.Conclusion: The rats of left ventricular hypertrophy with overloaded pressure had increased miR-34a and decreased α-MHC, LNA-anti-miR-34a could elevate α-MHC expression and therefore, reduce or delay the myocardial hypertrophy and improve the cardiac function.

Ventricular hypertrophic; MicroRNA-34a; Myosin heavy chain-α

2013-08-22）

（編輯：王寶茹）

河南省科技廳科研基金（72102310023）

450014 河南省鄭州市，鄭州大學第二附屬醫(yī)院 心內科（楊蕊珂、王淑輝、張強），心電圖科（楊麗紅）；鄭州大學基礎醫(yī)學院生理教研室（喬鵬）； 河南省人民醫(yī)院（徐金義、李涵）

楊蕊珂 碩士研究生 主要從事高血壓相關臨床與基礎研究 Email: qiaoyangguo@163.com 通訊作者：張強Email: zq3397@163.com

R54

A

1000-3614（2014）02-0138-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.02.015

方法: 將40只雄性SD大鼠隨機分為4組（n=10），分別為腹主動脈縮窄術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/AAC組），腹主動脈縮窄術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/AAC組），假手術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物組（ant-34a/SH組）， 假手術后皮下注射miRNA-34a表達阻遏物陰性對照物組（con/SH組）。模型建立第12周存活大鼠：ant-34a/AAC組6只，con/AAC組7只，ant-34a/SH組8只，con/SH組8只。測定各組大鼠左心室收縮壓、左心室舒張末期壓及壓力最大變化速率，計算心肌肥厚指數(shù)，觀察心肌組織病理學改變，應用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（ qRT-PCR）檢測大鼠左心室心肌組織miRNA-34a、肌球蛋白重鏈α基因表達水平。

結果：與con/AAC組相比， ant-34a/AAC組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及miRNA-34a相對表達量降低，壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（P均＜0.05）。與con/AAC組相比，con/SH組心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓以及 miRNA-34a相對表達量明顯降低，壓力最大變化速率、肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（ P均＜0.05）。與con/SH組相比，ant-34a/SH組miRNA-34a相對表達量明顯降低，肌球蛋白重鏈α基因相對表達量明顯升高（ P均＜0.05），心肌肥厚指數(shù)、左心室收縮壓、 左心室舒張末期壓、壓力最大變化速率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

結論：壓力負荷性左心室肥厚大鼠心肌組織中 miRNA-34a表達上調，肌球蛋白重鏈α基因表達減少，利用特異性阻遏物阻斷 miRNA-34a表達可使大鼠肥厚心肌組織肌球蛋白重鏈α基因表達水平增高，減輕或者延緩心肌肥厚、提高心肌順應性、改善心功能。