馬夢婷，蔡 武，魏武軍，陳曉莉，高慶華

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)局；3.新疆和田縣畜牧獸醫(yī)局)

牛超低劑量性控分選冷凍精液人工授精試驗

馬夢婷1，蔡 武2，魏武軍3，陳曉莉1，高慶華1

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)局；3.新疆和田縣畜牧獸醫(yī)局)

試驗旨在檢驗使用超低劑量牛性控分選冷凍精液人工授精的效果。將180頭牛分為3組進行人工授精，常規(guī)冷凍精液組（C，n=60）和經(jīng)流式細胞分離的兩種劑型（X1，n=60；X2，n=60）的X冷凍精液組，常規(guī)凍精有效精子數(shù)（1 125.1±109.4）×104，X1型和X2型凍精有效精子數(shù)分別為（102.3±9.6）×104和（51.9±4.8）×104。結(jié)果顯示：X1型凍精和X2型凍精的90 d受胎率分別為53.3%和47.7%，低于常規(guī)凍精組的66.7%（P＜0.05)；X1型凍精和X2型凍精組母犢率分別為93.8%和100%，明顯高于常規(guī)凍精組的43.9%（P＜0.05）。兩種劑型X凍精和常規(guī)凍精配種所產(chǎn)犢牛出生重分別為33.7 kg±5.2 kg和34.4 kg±4.5 kg，差異不顯著（P>0.05）；母牛妊娠期均在270～300 d的正常范圍內(nèi)。

奶牛；超低劑量分選精液；人工授精；產(chǎn)母犢率

控制減少雄性出生，增加雌性后代的比例，對快速增加良種牛數(shù)量有十分重要的意義［1-2］。目前，流式細胞分離精子授精是控制哺乳動物性別最為可靠的技術(shù)［3］。牛精子易于分選和冷凍，牛性控凍精已商業(yè)化，國內(nèi)每支含2.3×106個精子（含有效精子1×106）的0.25 mL牛細管凍精的售價在150～300元人民幣，其純度和密度基本可以滿足低劑量輸精的要求［4-5］。但是，受專利和生產(chǎn)成本的限制，分選性控精液的高成本在今后相當長的時間內(nèi)是限制其廣泛用于生產(chǎn)的一個主要因素［2］，而通過提高性控精液的利用效率是當前降低成本的最重要途徑。在奶牛、馬鹿、梅花鹿和奶山羊性控精液的試驗研究中，都曾有過使用了5.0×105甚至更低數(shù)量有效精子的輸精劑量，這些試驗已經(jīng)獲得了正常受胎率和預(yù)知性別的后代［6-7］，關(guān)鍵是要在生產(chǎn)中掌握精準的授精時間、輸精部位，并結(jié)合輸精前的促排技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆和田縣和阿合奇縣4個農(nóng)業(yè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)體況良好的青年雜交母牛180頭；冷凍精液購自XY公司，3頭公牛號為11035、03162、10203，每頭公牛的X型冷凍精液采用0.25 mL細管分裝，為2.5×106和1.2×106兩種劑型，常規(guī)冷凍精液采用0.25 mL細管分裝，為2.5×107/管，凍精活率均≥0.4，液氮保存；顯微鏡，胚胎移植槍及耗材（法國卡蘇），液氮罐，磅秤。

1.2 方法

試驗在2011年和2012年的4—6月進行，180頭青年雜交母牛被分為X1、X2、C三組；觀察牛的發(fā)情情況，以母牛爬跨其他母牛，同時接受其他母牛爬跨，并有吊線為發(fā)情特征，每天至少觀察發(fā)情4次并記錄；凍精細管在37℃溫水中解凍，每組各取12個解凍細管樣本，采用血球計數(shù)板間接法測定有效精子數(shù)（單位：104精子）。

C組60頭當?shù)厍嗄昴概２捎贸Ｒ?guī)冷凍精液，在首次觀察到發(fā)情牛穩(wěn)定接受爬跨后12 h以1管常規(guī)凍精劑量進行一次人工授精，授精部位在子宮體；對120頭當?shù)厍嗄昴概２捎肵型冷凍精液人工授精，時間為首次觀察到發(fā)情牛接受爬跨后16 h，輸精前直腸檢查卵泡發(fā)育情況，在優(yōu)勢卵泡側(cè)子宮角深部用胚胎移植槍進行一次直腸把握授精，3頭公牛的兩種劑型的X凍精間隔交替使用，每次1管性控冷凍精液；授精使用2.5×106劑型為X1組（60頭），1.2×106劑型為X2組（60頭）。人工授精后對90 d不返情母牛直腸檢查定胎，統(tǒng)計情期受胎率（%），產(chǎn)犢后統(tǒng)計母犢率（%），妊娠時間（d），并測量其初生體重（kg）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

有效精子數(shù)均數(shù)及標準差，90 d受胎率和產(chǎn)母率進行χ2檢驗，初生重和妊娠期數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 分選凍精和常規(guī)凍精人工授精結(jié)果比較

由表1可看出，每管X1凍精（0.25 mL）與每管X2凍精（0.25 mL）解凍后精子活力和有效精子數(shù)相比差1倍，其中X1凍精與常規(guī)凍精的有效精子數(shù)相差10倍。X1型凍精人工授精90 d受胎率為53.3%，X2型凍精90 d受胎率為47.7%，常規(guī)凍精為66.7%，X2型凍精人工授精90 d的受胎率低于X1型的，而X1型凍精人工授精90 d的受胎率又低于常規(guī)凍精的。X1型凍精和X2型凍精性控精液產(chǎn)母率分別達93.8%和100%，遠偏離對照43.9%的母犢率。

表1 分選X型凍精和常規(guī)凍精人工授精結(jié)果對比

2.2 分選X型凍精和常規(guī)凍精所產(chǎn)母犢牛比較

由表2可看出，經(jīng)流式細胞分離的X型和常規(guī)冷凍精液經(jīng)人工授精，測量其后代出生重無顯著差異（P>0.05），經(jīng)X型凍精和常規(guī)凍精人工授精的母牛妊娠期都在270～290 d的正常范圍之內(nèi)。

表2 分選X型凍精和常規(guī)凍精所產(chǎn)母犢牛出生體重和妊娠期

3 討論

超低劑量輸精是本試驗的主要特點，試驗結(jié)果中兩種低劑量性控精液的情期受胎率分別為53.3%和47.7%，雖比常規(guī)精液的情期受胎率（66.7%）低，但在生產(chǎn)中可以接受，性控效果達93%以上，并且妊娠期和胎兒出生情況與常規(guī)精液后代相比都正常。這個試驗證明了采用商品性控凍精半劑量授精的可能性。

Seidel等發(fā)現(xiàn)在奶牛上采用低劑量或超低劑量輸精也可達到常規(guī)70%的情期受胎率［7］，而對于我國農(nóng)村鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛場情期受胎率如能夠達50%則較為滿意，此次試驗兩種低劑量性控精液的情期受胎率分別為53.3%和47.7%。

當前推廣分選的性控精液有兩個主要問題：性控精液成本較高和情期受胎率低［2］。X型精液輸精一次約200元，受胎1頭約需要500元，遠高于常規(guī)凍精的成本，但X型精液受機器分選效率的限制、專利使用費和市場因素的影響，其價格不會有大的下降，所以在保持情期受胎率基礎(chǔ)上降低輸精劑量是推動該技術(shù)更廣泛應(yīng)用的一個有效途徑。

分離過程對精子會造成更多的損傷，而精子DNA的損傷可能會影響受胎率與后代的遺傳穩(wěn)定性［8-9］。已經(jīng)有相當多的試驗證實：同樣劑量的性控凍精與常規(guī)凍精的受胎率沒有差異，這說明不會顯著影響受胎效果［9-10］。本試驗中性控精液產(chǎn)母率達93%以上是令人滿意的。X型精液人工授精后所產(chǎn)母犢早期出生重和懷孕期與常規(guī)凍精生產(chǎn)的后代沒有差異，初步證明應(yīng)用這個技術(shù)出生的性控后代的表型是正常的。

用分離X和Y精子的性控精液進行人工授精是控制家畜性別之最簡單可行的方法。然而,低密度性控精液輸精效果還不如常規(guī)人工授精,許多技術(shù)環(huán)節(jié)都有待改進［11-12］。挑選能夠熟練從事胚胎移植操作技術(shù)的輸精員，精確控制人工授精各個技術(shù)環(huán)節(jié)可以縮小性控與非性控、低密度與高密度精液之間的差別，獲得高妊娠率。

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S823.3

A

2095-3887（2014）02-0022-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.007

2013-12-31

兵團博士資金項目（2010JC20）；兵團科技攻關(guān)計劃課題（2011AB065）

馬夢婷（1991-），女，碩士。

高慶華（1970-），男，教授，博士。主要研究方向：動物胚胎工程。