張 艷，王金鴻，呂亞莉，菅復春，張龍現(xiàn)，寧長申

（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002）

六種試劑盒提取血液基因組DNA效果比較

張 艷，王金鴻，呂亞莉，菅復春，張龍現(xiàn)，寧長申

（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州 450002）

為篩選一種高效、快捷的血液基因組DNA提取試劑盒，采集24份新鮮西藏綿羊血液樣本，選用6種市售商業(yè)化試劑盒（LifeFeng柱式試劑盒DK601和非柱式試劑盒DK602，康為世紀非柱式試劑盒CW0544和柱式試劑盒CW0546，上海生工非柱式試劑盒SK8224和柱式試劑盒SK8254）,比較所提DNA的濃度、純度、得率以及對嗜吞噬細胞無形體16S rRNA進行巢式PCR擴增，綜合評價不同試劑盒DNA提取效果。結(jié)果表明，應(yīng)用LifeFeng柱式試劑盒DK601提取的DNA濃度和純度均最高，得率較高，分別達到75.63 ng/μL、1.894（OD260/OD280）、18.91 ng/μL；且嗜吞噬細胞無形體16S rRNA基因的PCR擴增條帶清晰度最優(yōu)。因此，LifeFeng DK601可作為提取綿羊血液基因組DNA及嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma phagocytophilum）病原鑒定的首選試劑盒。

DNA提取試劑盒；血液基因組DNA；PCR

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種重要的分子生物學診斷技術(shù)［1-2］，而該技術(shù)依賴于高質(zhì)量的DNA樣本。因此，提取到高質(zhì)量、純度好、結(jié)構(gòu)完整的DNA對于分子生物學試驗至關(guān)重要。目前除了經(jīng)典的苯酚氯仿抽提法、異丙醇沉淀法外，還建立了玻璃珠吸附法、三乙醇胺月桂基硫酸鹽法、鹽析法等DNA提取方法［3］。不同DNA提取方法具有不同的特點。

依據(jù)相關(guān)的DNA提取原理，目前已開發(fā)出了數(shù)量眾

多的DNA提取試劑盒。如基于異丙醇沉淀法，上海LifeFeng、北京康為世紀、上海生工等國內(nèi)著名的生物技術(shù)公司分別推出了以DK602、CW0544、SK8224等為主的試劑盒?；诠枘z吸附原理，上述3家公司分別生產(chǎn)了DK601、CW0546、SK8254等產(chǎn)品。目前這些商業(yè)化基因組DNA提取試劑盒已得到廣泛應(yīng)用，但由于不同試劑盒因DNA提取的原理、技術(shù)水平及產(chǎn)品質(zhì)量不同，其成本也有所不同。另外，由于試驗?zāi)康牟煌芯空邔NA質(zhì)量和數(shù)量的要求也有所不同。在臨床和科研工作中，受采集條件所限，采集到的血液樣品的量通常較少。因此，篩選高效、快捷且適用于提取少量血液樣本的DNA提取試劑盒非常關(guān)鍵。本研究使用市場上常見的幾種血液基因組DNA提取試劑盒對綿羊血液基因組DNA的提取效果進行比較，旨在確定適合檢測本實驗室病原嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma phagocytophilum）的試劑盒，為相關(guān)的綿羊分子生物學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

24份血液樣品采自河南省駐馬店市確山縣竹溝鎮(zhèn)奧森生態(tài)羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社飼養(yǎng)的6～7月齡的西藏綿羊，4℃冰箱內(nèi)保存2 d。嗜吞噬細胞無形體陽性DNA為本實驗室保存。

1.2 試劑

上海LifeFeng非柱式（DK602）和柱式（DK601）血液DNA提取試劑盒、北京康為世紀非柱式（CW0544）和柱式（CW0546）血液DNA提取試劑盒、上海生工非柱式（SK8224）和柱式（SK8254）分別購自鄭州道合偉業(yè)生物科技有限公司、鄭州暢佳商貿(mào)有限公司、鄭州鑫勵揚生物科技有限公司。引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司合成。PCR反應(yīng)使用的酶、dNTPs、緩沖液等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

ABI 2720型PCR儀購自杭州朗基科學儀器有限公司，DYY-5型電泳儀及電泳槽購自北京市六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene公司，NanoDrop2000紫外分光光度計購自美國ThermoFisher公司。

1.4 方法

1.4.1 血液基因組DNA提取 使用6種試劑盒提取24份新鮮血液樣品的DNA，每份均使用200 μL血樣，依據(jù)試劑盒說明書進行操作。提取DNA后，應(yīng)用紫外分光光度計測定DNA濃度和OD260/OD280值，并根據(jù)公式計算出DNA得率（ng/μL）=DNA濃度（ng/μL）×DNA體積（μL）/取材量（μL）［3］。

1.4.2 嗜吞噬細胞無形體16S rRNA巢式PCR擴增驗證

參照Barlough等［4］報道的引物EE1和EE2擴增無漿體16SrRNA基因，該引物具有無漿體屬特異性。種特異性引物SSAP2參照Kawahara等［5］擴增嗜吞噬細胞無形體時所用引物。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中滅菌去離子水18.25 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mM）2 μL，上下游引物各0.5 μL（25 μmol/L），LATaq（5 U/μL）0.25 μL, DNA模板1 μL。第二輪PCR反應(yīng)的模板為第一輪PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件均為94℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于-20℃保存，取5 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。每個試驗重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將不同試劑盒提取的樣品DNA濃度、純度和得率均以M±SD表示，用GraphPad Prism軟件進行方差分析，多重比較采取Duncan氏法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種試劑盒提取基因組DNA的效果比較

從表1和圖1可見，使用相同量的血液樣本，上海LifeFengDK602和北京康為世紀CW0544兩種非柱式提取試劑盒提取的DNA的平均濃度相對較低，各樣本濃度均低于40 ng/μL，且樣本間變異較小。上海生工的SK8224非柱式提取試劑盒提取的DNA平均濃度雖然較高，但大部分樣品的濃度在20 ng/μL以下，但樣本間差異很大，說明該試劑盒提取效果很不穩(wěn)定。在3種柱式提取試劑盒中，上海LifeFengDK601的DNA濃度最高，是其他柱式試劑盒及非柱式試劑盒的2～3倍，且穩(wěn)定性較好。其他2種柱式試劑盒（北京康為世紀CW0546和上海生工SK8254）與3種非柱式試劑盒提取的DNA濃度接近或略高，但上海生工SK8254柱式試劑盒的穩(wěn)定性較差。

應(yīng)用不同試劑盒提取的DNA純度和得率也有一定差異。相對而言，北京康為世紀CW0544非柱式試劑盒提取的DNA純度最低，而上海LifeFengDK601柱式試劑盒提取的DNA純度最高，說明該試劑盒提取的DNA質(zhì)量最好。上海生工SK8224非柱式試劑盒得率最高，上海LifeFengDK601柱式試劑盒得率次之，而兩種柱式試劑盒（北京康為世紀CW0546和上海生工SK8254）得率最低。

不同試劑盒提取DNA的成本和耗時也不同。3種非柱式試劑盒成本較低，上海LifeFengDK601柱式試劑盒成本屬于中等，而另兩種柱式試劑盒成本很高。在提取時間方面，3種非柱式試劑盒花費時間較多，而3種柱式試劑盒所需時間相對較少。

表1 6種試劑盒提取基因組DNA的濃度、純度和得率

圖1 不同試劑盒DNA濃度散點圖

2.2 6種試劑盒提取基因組DNA的PCR驗證結(jié)果

對6種試劑盒提取的基因組DNA進行巢式PCR擴增，得到嗜吞噬細胞無形體的16S rRNA基因的結(jié)果見圖2。從圖2可見，在均取1 μL DNA作為模板進行PCR的情況下，在非柱式提取法中，上海LifeFeng DK602的目的條帶最亮，上海生工SK8224的亮度次之。在柱式提取法中，上海LifeFeng DK601和上海生工SK8254的目的條帶清晰，亮度相當，而康為世紀CW0546的效果較差。

圖2 6種試劑盒提取DNA的PCR擴增電泳結(jié)果

3 小結(jié)與討論

目前提取DNA的方法很多，不同方法各有優(yōu)缺點。異丙醇沉淀法的優(yōu)勢是簡便快捷，實驗成本低，得到的DNA量較大，且對實驗設(shè)備要求不高，然而該方法提取的DNA因未經(jīng)后續(xù)純化，可能混雜有少量RNA和蛋白質(zhì)，因此得到的DNA純度有限，通常此法提取的DNA其OD260/OD280值小于1.8。相對于傳統(tǒng)的異丙醇沉淀法，目前大量商業(yè)化的DNA提取試劑盒多采用硅膠吸附原理來抽提DNA，該方法因其可高效快速提取到高純度DNA而受到廣大科研和臨床工作人員的青睞，盡管此方法得到DNA的數(shù)量較少。

本研究選擇6種試劑盒提取基因組DNA，并根據(jù)所得DNA的濃度、純度和得率以及PCR擴增嗜吞噬細胞無形體16SrRNA的效果來評價DNA質(zhì)量。在3種非柱式提取法試劑盒中，上海生工試劑盒SK8224提取的DNA平均濃度最高，但提取結(jié)果穩(wěn)定性差；上海LifeFeng試劑盒DK602提取的DNA經(jīng)巢式PCR擴增得到的條帶最亮，且成本最低。然而3種非柱式提取法試劑盒提取的DNA其OD260/OD280值均未小于1.8，說明這些DNA可能有蛋白質(zhì)污染。3種柱式提取法試劑盒提取的DNA其OD260/OD280值均高于非柱式，上海LifeFeng試劑盒DK601提取的DNA濃度、純度和得率在3種柱式產(chǎn)品

中最好，并且穩(wěn)定性在6種試劑盒中也較高，嗜吞噬細胞無形體16SrRNA巢式PCR的條帶亮度也印證了這一結(jié)果。綜上所述，在對DNA純度要求較高的情況下，上海LifeFeng柱式血液基因組DNA提取試劑盒DK601較適合，而如果對DNA純度要求不高且需檢測大量樣本的情況下，如在進行分子流行病學調(diào)查試驗中，上海LifeFeng非柱式血液基因組DNA提取試劑盒DK602較適合，因其花費的成本較低且PCR擴增效果也很好?？偟膩碚f，這兩種試劑盒均適用于本實驗室提取綿羊血液基因組DNA并擴增嗜吞噬細胞無形體。

［1］高健，劉海，周玉財，等.奶牛乳房炎病原菌的PCR診斷技術(shù)研究進展［J］.中國奶牛，2013（4）:31-33．

［2］梁民，蔣柳平，黃溢泓，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經(jīng)典株RT-PCR鑒別診斷技術(shù)及其臨床應(yīng)用［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，2011，42（8）：991-994．

［3］張寧，王鳳山.DNA提取方法進展［J］.中國海洋藥物，2004（2）：40-46．

［4］Barlough J E，Madigan J E，DeRock E，et al.Nested polymerase chain reaction for detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks（Ixodespacificus）［J］.Veterinary Parasitology，1996，63（3-4）：319-329.

［5］Kawahara M，Rikihisa Y，Lin Q，et al.Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum，Anaplasma bovis，Anaplasma centrale，and a novel Ehrlichia sp.in wild deer and ticks on two major Islands in Japan［J］. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（2）：1102-1109.

Comparison of DNA Extraction Effects by 6 Blood Genomic DNA Extraction Kits

Zhang Yan，Wang Jin-hong，Ning Chang-shen，et al
（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China）

In order to select a relatively better DNA extraction kit for the extraction of genomic DNA,fresh blood samples were taken from 24 Tibetan sheep，and 6 commercial kits，including the LifeFeng DNA extraction kit DK601 and 602，CWBIO DNA extraction kit CW0544 and CW0546，Sangon DNA extraction kit SK8224 and SK8254，were chosen as the DNA extraction reagents.The qualities ofextracted DNAs were evaluated by determination of the concentrations，the purities and extraction rates，as well as the effects of nested PCR targeted for the Anaplasma phagocytophilum 16S rRNA gene.The results showed that the highest DNAconcentration，purityand extraction rate，which came up to75.63 ng/μL，1.894（OD260/OD280）and 18.91 ng/μL，respectively，could been achieved byemployingthe LifeFengDNAextraction kit DK601.Furthermore，the best results ofPCR reaction were observed usingthe DNAsamples harvested fromthis kit.It therefore been concluded that the LifeFengDNAextraction kit DK601 was the relativelybetter reagent for the genomic DNAextraction and detection of Anaplasma phagocytophilum from the blood in sheep research.

DNAextraction kit；blood genomic DNA；PCR

S826.2

A

2095-3887（2014）02-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.002

2014-02-18

國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（nycytx-39）

張艷（1986-），女，博士研究生。

寧長申（1958-），男，教授。