廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心腫瘤3區(qū)，廣東 湛江 524000

血漿miR-221在小細(xì)胞肺癌患者血漿中的表達(dá)及其臨床意義

馮麗萍 羅亮 蘇文媚

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心腫瘤3區(qū)，廣東 湛江 524000

背景與目的：MicroRNAs(miRNAs,miR)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤組織中miRNAs表達(dá)水平的變化可能會(huì)引起循環(huán)miRNAs隨之改變。本研究目的是探討小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)患者臨床標(biāo)本中miR-221的表達(dá)及其臨床意義。分析miR-221在51例SCLC患者及20例健康對(duì)照者血漿和組織中的表達(dá)及其與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)51例SCLC患者癌組織、癌旁及正常組織中miR-221的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)血漿miR-221在51例SCLC患者及20例健康對(duì)照者中的表達(dá)。結(jié)合臨床資料分析其表達(dá)在臨床中的作用和意義，判定血漿miR-221能否作為SCLC早期診斷、治療及預(yù)后的標(biāo)志。結(jié)果：miR-221在SCLC組織中的表達(dá)水平較癌旁及正常肺組織高；血漿miR-221在SCLC患者中的表達(dá)較健康對(duì)照者高(P＜0.05)。miR-221的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05)，與疾病分期、對(duì)化療的敏感性及生存期密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)疾病分期、miR-221的表達(dá)可作為獨(dú)立的預(yù)后因子。結(jié)論：血漿miR-221的表達(dá)與SCLC的腫瘤分期、對(duì)化療的敏感性和生存期相關(guān)。檢測(cè)血漿miR-221可作為評(píng)估SCLC患者臨床預(yù)后的靶基因。

小細(xì)胞肺癌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；血漿miR-221

小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一種以生長(zhǎng)迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點(diǎn)的肺癌類(lèi)型，其發(fā)病率占原發(fā)性肺癌的15%～20%［1-2］。SCLC的腫瘤細(xì)胞雖對(duì)化療和放療都非常敏感，但多方案的臨床試驗(yàn)并沒(méi)能找到徹底治愈SCLC的有效方法，多數(shù)患者在一線(xiàn)治療以后仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后差［3-4］。因此，需要從分子層面尋找有效的診斷、治療、監(jiān)測(cè)等標(biāo)志物；此外，與SCLC、乳腺癌等腫瘤相比，SCLC化療藥物、靶向藥物非常有限。

MicroRNAs(miRNAs，miR)是一種內(nèi)源性的非編碼RNA(ncRNA)，由17～25個(gè)堿基組成單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中。miRNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后控制調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)。在腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估等方面，多個(gè)組織miRNA表達(dá)譜已被鑒定為重要的標(biāo)志物［5-6］。血漿里同樣可以檢測(cè)到miRNA，循環(huán)miRNA來(lái)源于腫瘤組織，受內(nèi)源性RNA酶的保護(hù)［7］。目前在淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌患者血漿中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)的miRNA，而且miRNA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-141能區(qū)分前列腺癌和健康對(duì)照志愿者，miR-21在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者血漿中升高，與患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期延長(zhǎng)相關(guān)［7-10］。在SCLC患者血漿中miR-92水平明顯升高，可以作為潛在的無(wú)創(chuàng)性診斷分子標(biāo)志物［11］。前期通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)miR-221在SCLC耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)降低。然而關(guān)于miR-221在SCLC臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SCLC患者外周血液中血漿miR-221及組織標(biāo)本中miR-221的表達(dá)，分析其血漿miR-221與組織中miR-221的相關(guān)性，進(jìn)一步明確血漿miR-221在SCLC診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

51例SCLC患者標(biāo)本取自2009年1月—2013年3月就診于廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科、胸外科及呼吸內(nèi)科的患者，其中男性26例，女性25例；患者年齡30～82歲，中位年齡53歲，53歲以下患者22例，53歲以上患者29例；廣泛期31例，局限期20例。對(duì)化療敏感者18例，對(duì)化療耐藥者33例。51例SCLC組織標(biāo)本為SCLC纖維支氣管鏡檢查及活檢組織，血液標(biāo)本為放化療前的標(biāo)本，所有標(biāo)本均為經(jīng)病理學(xué)檢查確診的SCLC，全部病例獲取前均未行化療和放療，臨床資料完整，患者未合并其他系統(tǒng)的疾病。20例正常血液標(biāo)本取自正常人體檢血液標(biāo)本，體檢證實(shí)未患腫瘤及其他疾病，20例非腫瘤組織為癌旁組織。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。全部108例患者出院后均隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)方式為電話(huà)隨訪(fǎng)和復(fù)查隨訪(fǎng)，內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。隨訪(fǎng)起點(diǎn)為確診日期，末次隨訪(fǎng)時(shí)間為2013年3月31日，至隨訪(fǎng)截止日，依然生存13例，死亡38例，無(wú)失訪(fǎng)病例。

1.2 RNA的提取

1.2.1 血漿RNA提取

500 μL低溫保存的血漿標(biāo)本，置于冰上融化，且充分混勻。加入500 μL TRIzol，vortex劇烈震蕩30 s，室溫靜置5 min；加200 μL異丙醇，顛倒混勻，vortex 劇烈震蕩2 min(至液體透明)，室溫靜置5 min；于4 ℃，13 000 r/min(離心半徑6.9 cm)離心15 min，將上清液移至新eppendorf管；加500 μL三氯甲烷，顛倒混勻，vortex劇烈震蕩1 min，室溫靜置5 min；于4 ℃，13 000 r/min(離心半徑6.9 cm)離心15 min，將上清液移至新的eppendorf管；加0.75體積的異丙醇至上清液中，顛倒混勻，室溫靜置10 min；于4 ℃，13 000 r/min(離心半徑6.9 cm)離心10 min，沉淀RNA；吸棄上清液，沉淀用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇洗1次；于4 ℃，7 500 r/min (離心半徑為6.9 cm)離心5 min，沉淀RNA；吸凈乙醇，30 μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA。

1.2.2 組織RNA提取

收集SCLC癌組織及癌旁組織(約50～100 mg)在液氮中磨成粉末后，加入1 mL TRIzol液研磨(樣品總體積不超過(guò)所用TRIzol體積的10%)，分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miR-221的表達(dá)

將上述血漿及組織中提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?6 ℃變性30 min，42 ℃延伸30 min，85 ℃終延伸10 min。結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置于冰上冷卻，后續(xù)所有步驟均在冰上進(jìn)行。將cDNA產(chǎn)物稀釋3～4倍，然后混勻并從中吸取2 μL(20 μL體系)做為定量PCR的模板，剩余產(chǎn)物存放于-20 ℃。PCR反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性12 s，62 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃終延伸15 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)real time PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)等。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式2-△△Ct的方法進(jìn)行分析?！鳌鰿t=(待測(cè)樣品的目的基因的Ct的平均值－待測(cè)樣本的管家基因的Ct的平均值)－(對(duì)照樣品的目的基因的Ct的平均值－對(duì)照樣本的看家基因的Ct的平均值)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?；颊哐杭敖M織標(biāo)本中miR-221的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)分析，以表示。miR-221的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用χ2檢驗(yàn)；生存分析用Kaplan-Meier法。組間生存曲線(xiàn)差別用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank test)；應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響SCLC預(yù)后的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-221在SCLC患者血漿及腫瘤組織中的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)51例SCLC患者和20例正常人血漿及腫瘤組織中miR-221的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-221在SCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)(9.64±1.09)高于癌旁組織(1.11±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A、B，P＜0.05)。ROC曲線(xiàn)面積為0.722(95%CI：0.597～0.847，圖1C)。SCLC患者血漿miR-221的相對(duì)表達(dá)水平(8.69±0.98)明顯高于健康對(duì)照(1.01±0.08) ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，圖2A、B)。ROC曲線(xiàn)分析證實(shí)，血漿miR-221可以作為區(qū)分SCLC患者和正常對(duì)照的潛在分子標(biāo)志物，ROC曲線(xiàn)面積為0.859(95%CI：0.783～0.934，圖2C)。

2.2 miR-221在SCLC中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

采用χ2檢驗(yàn)分析miR-221的表達(dá)與患者年齡、性別、疾病分期、對(duì)化療的敏感性及患者生存期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-221的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05，表1)；與患者對(duì)化療藥物的敏感性、疾病分期及生存期密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001，表1)。

2.3 SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性患者與女性患者的生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.155，P=0.230)?！?3歲的患者與＞53歲患者生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.049，P=0.092)；局限期患者的生存期長(zhǎng)于廣泛期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.631，P＜0.001)；miR-221低表達(dá)者的生存期長(zhǎng)于高表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.638，P＜0.001)，化療敏感者患者的生存期長(zhǎng)于化療耐藥者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.907，P＜0.001，圖3).

采用Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期及促分泌素表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)疾病分期和miR-221表達(dá)可作為獨(dú)立的預(yù)后因子，廣泛期患者的相對(duì)危險(xiǎn)度為3.993，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(95%CI：2.172～13.606，χ2=4.898，P=0.027)；miR-221高表達(dá)的相對(duì)危險(xiǎn)度為8.569，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(95%CI：4.375～21.513，χ2=28.703，P＜0.001，表2)。

圖1 miR-221在51例SCLC患者癌組織和20例癌旁組織及正常肺組織中的表達(dá)Fig. 1 The miR-221 expression in the cancer tissues of 51 SCLC patients and the para-cancerous tissues and normal tissues in 20 healthy volunteers

圖2 miR-221在51例SCLC患者和20例正常人血漿中的表達(dá)Fig. 2 The miR-221 expression in the serum of 51 consecutive SCLC patients and 20 healthy volunteers

表1 miR-221的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系Tab. 1 Association of miR-221 with clinical parameters

圖3 比較不同的疾病分期、miR-221的表達(dá)及化療敏感性與患者生存時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Compare of survival times considering stage, miR-221 expression and sensitivity to drugs

表2 Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)疾病的分期和miR-221的表達(dá)與SCLC預(yù)后的關(guān)系Tab. 2 Cox regression analysis identi fi ed the relationship of miR-221 and stage with prognostic of SCLC patients

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)miRNA在很多腫瘤異常表達(dá)，與腫瘤的關(guān)系密切，涉及諸多方面，包括腫瘤形成、侵襲轉(zhuǎn)移、分期預(yù)后、治療反應(yīng)、療效預(yù)測(cè)、耐藥等［12］。在不同腫瘤中的差異表達(dá)及其與腫瘤的分類(lèi)、診斷和治療的相關(guān)性,提示其可能成為腫瘤預(yù)后檢測(cè)的重要生物標(biāo)志分子。Yamamoto等［13］發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者血漿中miR-500高表達(dá)，而3例肝癌術(shù)后患者血漿中miR-500表達(dá)恢復(fù)到正常水平，提示miR-500血漿表達(dá)水平不僅可用于肝癌發(fā)展過(guò)程變化的診斷，還能夠反映患者病程的發(fā)展過(guò)程。腫瘤切除后，測(cè)定患者血液中miR-500等能夠盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移等情況，有利于決定下一步的治療方案。Hu等［14］對(duì)303例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)進(jìn)行了miRNA分析，發(fā)現(xiàn)有4種miRNA與患者的生存期密切相關(guān)，并且4種miRNA與NSCLC分期有關(guān)，這種特異性的miRNA分析，有可能為NSCLC患者病程的預(yù)測(cè)以及選擇更適合的治療方法提供依據(jù)。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)miR-221通過(guò)調(diào)節(jié)數(shù)百種mRNA的表達(dá)，影響多種腫瘤的信號(hào)通路［15］。miR-221在胰腺癌［16］、乳頭狀甲狀腺癌［17］、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［18-19］、乳腺癌［20］和前列腺癌［21］等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。高表達(dá)的miR-221與腫瘤生成、治療、耐藥相關(guān)。在前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中miR-221高表達(dá)的患者預(yù)后較差［19,21-22］。miR-221在腎癌患者循環(huán)中的高表達(dá)與其預(yù)后差相關(guān)［23］。miR-221促進(jìn)三陰性乳腺癌腫瘤的形成［24］；增加miR-221的表達(dá)能夠減少T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病患者的生存期［25］。與本 研究結(jié)果一致，我們采用QRT-PCR對(duì)51例SCLC患者和20例正常人血漿及組織中miR-221的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SCLC患者腫瘤組織及循環(huán)中miR-221的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照者。ROC曲線(xiàn)分析證實(shí)miR-221作為區(qū)分SCLC患者和正常對(duì)照的潛在分子標(biāo)志，血漿中miR-221的水平能夠反映SCLC腫瘤組織中的miR-221表達(dá)水平。miR-221的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)相關(guān)性，與患者對(duì)化療藥物的敏感性、疾病分期及生存期密切相關(guān)。采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存期，患者的生存期與性別、年齡無(wú)關(guān)，與疾病的分期、患者對(duì)化療藥物的敏感性及miR-221的表達(dá)相關(guān)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)腫瘤分期和miR-221可作為獨(dú)立的預(yù)后因子。以上結(jié)果提示通過(guò)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)血漿miR-221可能作為SCLC潛在的早期診斷、預(yù)后及療效評(píng)價(jià)的分子標(biāo)志物。

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The expression and clinical signi fi cance of miR-221 in plasma of patients with small cell lung cancer

FENG Li-ping, LUO Liang, SU Wen-mei (the Third Branch of Cancer Center, the Af fi liated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang Guangdong 524000, China)

FENG Li-ping E-mail: 6985626@qq.com

Background and purpose:MicroRNAs (miRNAs, miR) are directly involved in cancer initiation, progression and metastasis. Alterations of miRNAs expression in cancer tissue may be reflected in circulation. We attempted to investigate the expression and clinical signi fi cance of plasma miR-221 in patients with small cell lung cancer (SCLC). The plasma and tissues levels of miR-221 in 51 SCLC patients and 20 controls were evaluated and compared among various clinicopathological characteristics.Methods:Confirmation of higher miR-221 levels in primary SCLC tissues than normal lung tissues. Evaluation of plasma miR-221 concentrations by comparing results from 51 consecutive SCLC patients and 20 healthy volunteers. Evaluation of the assay for monitoring tumour dynamics in SCLC patients.Results:Expression of miR-221 was signi fi cantly higher in SCLC tissues than in para-carcinoma tissues and normal lung tissues. Plasma miR-221 concentrations were signi fi cantly higher in SCLC patients than those in normal people (P＜0.05). The expression of plasma miR-221 was not associated with gender, and age (P＞0.05), correlated with significantly chemosensitivity, overall survival and clinical stage (P＜0.05). Cox regression analysis indicated that plasma miR-221 expression and disease stage were found to be significantly independent prognostic factors for the SCLC patients.Conclusion:Plasma miR-221 could be a useful biomarker for cancer detection, monitoring tumour dynamics and predicting malignant outcomes in SCLC patients, and may contribute to clinical decision making in treatments.

Small cell lung cancer; QRT-PCR; Circulating miR-221

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.011

R734.2

A

1007-3639(2014)03-0217-08

2013-10-30

2014-02-10）

馮麗萍 E-mail:6985626@qq.com