鄒漢法等

摘要：利用蛋白質(zhì)組學方法，將大鼠肝微粒體樣品進行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應監(jiān)測模式（MRM），通過測定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實現(xiàn)同時對大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對定量。本實驗首先建立標準工作曲線，對肝微粒體樣品中P450和UGT進行定量，在線性范圍內(nèi)，相關系數(shù)r>0.995，線性關系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標，對UGT1A1進行定量分析。結果表明，同位素標記特征肽段與未標記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應一致，在基質(zhì)溶液中同位素標記肽段線性關系良好，利用標準曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡便，更適用于復雜樣品的高通量測定。

關鍵詞：葡萄糖醛酸轉移酶； 多反應監(jiān)測； 肝微粒體； 細胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進入體內(nèi)，可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進行清除。當藥物主要以代謝方式清除時，代謝途徑對藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細胞色素P450酶（簡稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶（UGT）介導絕大部分的代謝反應。因此，實現(xiàn)對P450和UGT家族中多種酶的定量，對研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動力學研究提供科學依據(jù)。在過去的研究中，常通過逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對藥物代謝酶進行評價。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響，因此測得的mRNA的量不能準確代表蛋白酶的水平； 又因為藥物代謝酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應，這些方法上的缺點都限制了對藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學研究中的應用，實現(xiàn)了對復雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實驗基礎。本實驗通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術以及標準曲線法，同時實現(xiàn)對P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標記肽段作為內(nèi)標，對復雜基質(zhì)中待測物進行定量。以往的間接定量實驗操作繁瑣，影響因素多，所得結果不能直觀反應實際藥物代謝酶水平。本實驗具有準確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點，可用于藥物代謝酶的相關研究。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1目標肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過對待測P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對肝微粒體酶解樣品進行測定[15]。根據(jù)樣品實際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過高分辨質(zhì)譜對肝微粒體樣品進行一級掃描 （圖1A）；然后對[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進行二級掃描和數(shù)據(jù)庫檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應監(jiān)測（MRM）模式對各酶亞型的特征肽段進行定量分析，需合成相應特征肽段的標準品進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過MRM實現(xiàn)對特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應所帶來的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標進行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標進行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測定

摘要：利用蛋白質(zhì)組學方法，將大鼠肝微粒體樣品進行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應監(jiān)測模式（MRM），通過測定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實現(xiàn)同時對大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對定量。本實驗首先建立標準工作曲線，對肝微粒體樣品中P450和UGT進行定量，在線性范圍內(nèi)，相關系數(shù)r>0.995，線性關系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標，對UGT1A1進行定量分析。結果表明，同位素標記特征肽段與未標記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應一致，在基質(zhì)溶液中同位素標記肽段線性關系良好，利用標準曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡便，更適用于復雜樣品的高通量測定。

關鍵詞：葡萄糖醛酸轉移酶； 多反應監(jiān)測； 肝微粒體； 細胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進入體內(nèi)，可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進行清除。當藥物主要以代謝方式清除時，代謝途徑對藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細胞色素P450酶（簡稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶（UGT）介導絕大部分的代謝反應。因此，實現(xiàn)對P450和UGT家族中多種酶的定量，對研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動力學研究提供科學依據(jù)。在過去的研究中，常通過逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對藥物代謝酶進行評價。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響，因此測得的mRNA的量不能準確代表蛋白酶的水平； 又因為藥物代謝酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應，這些方法上的缺點都限制了對藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學研究中的應用，實現(xiàn)了對復雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實驗基礎。本實驗通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術以及標準曲線法，同時實現(xiàn)對P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標記肽段作為內(nèi)標，對復雜基質(zhì)中待測物進行定量。以往的間接定量實驗操作繁瑣，影響因素多，所得結果不能直觀反應實際藥物代謝酶水平。本實驗具有準確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點，可用于藥物代謝酶的相關研究。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1目標肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過對待測P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對肝微粒體酶解樣品進行測定[15]。根據(jù)樣品實際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過高分辨質(zhì)譜對肝微粒體樣品進行一級掃描 （圖1A）；然后對[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進行二級掃描和數(shù)據(jù)庫檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應監(jiān)測（MRM）模式對各酶亞型的特征肽段進行定量分析，需合成相應特征肽段的標準品進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過MRM實現(xiàn)對特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應所帶來的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標進行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標進行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測定

摘要：利用蛋白質(zhì)組學方法，將大鼠肝微粒體樣品進行胰蛋白酶水解；再利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS），采用多反應監(jiān)測模式（MRM），通過測定蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的特征酶切肽段，實現(xiàn)同時對大鼠肝微粒體內(nèi)藥物代謝酶P450和UGT的絕對定量。本實驗首先建立標準工作曲線，對肝微粒體樣品中P450和UGT進行定量，在線性范圍內(nèi)，相關系數(shù)r>0.995，線性關系良好，定量限≤10 nmol/L；以合成的穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標，對UGT1A1進行定量分析。結果表明，同位素標記特征肽段與未標記肽段色譜行為與質(zhì)譜響應一致，在基質(zhì)溶液中同位素標記肽段線性關系良好，利用標準曲線法和穩(wěn)定同位素稀釋法測得UGT1A1含量分別為17.30和18.23 nmol/g，兩種方法所得結果基本一致，但穩(wěn)定同位素稀釋法操作簡便，更適用于復雜樣品的高通量測定。

關鍵詞：葡萄糖醛酸轉移酶； 多反應監(jiān)測； 肝微粒體； 細胞色素P450； 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1引言

藥物進入體內(nèi)，可以通過代謝以一種或多種有活性的或無活性的代謝產(chǎn)物形式進行清除。當藥物主要以代謝方式清除時，代謝途徑對藥物的安全性和療效有很大的影響[1，2]。在參與藥物代謝的各類酶中，細胞色素P450酶（簡稱CYP或P450）和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉移酶（UGT）介導絕大部分的代謝反應。因此，實現(xiàn)對P450和UGT家族中多種酶的定量，對研究藥物代謝具有重要意義，從而為藥物研發(fā)、藥物藥物相互作用（DDI）及臨床前藥代動力學研究提供科學依據(jù)。在過去的研究中，常通過逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RTPCR）[3，4]、2維電泳法（2DPAGE）[5]＼，免疫印跡法（Western blotting）[6，7]及探針底物法[8，9]對藥物代謝酶進行評價。由于mRNA的翻譯過程受多種因素的影響，因此測得的mRNA的量不能準確代表蛋白酶的水平； 又因為藥物代謝酶具有高度的序列同源性，使得現(xiàn)有方法專屬性差，伴有一定的交叉反應，這些方法上的缺點都限制了對藥物代謝酶的研究。

隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展和在蛋白質(zhì)組學研究中的應用，實現(xiàn)了對復雜體系中蛋白肽類物質(zhì)的定性和定量研究[10～14] ，也為藥物代謝酶的定量提供了理論依據(jù)和實驗基礎。本實驗通過分析藥物代謝酶的氨基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術以及標準曲線法，同時實現(xiàn)對P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素標記肽段作為內(nèi)標，對復雜基質(zhì)中待測物進行定量。以往的間接定量實驗操作繁瑣，影響因素多，所得結果不能直觀反應實際藥物代謝酶水平。本實驗具有準確性高，重現(xiàn)性好，定量限低，高通量等優(yōu)點，可用于藥物代謝酶的相關研究。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1目標肽段的選擇及色譜、質(zhì)譜條件的確定

通過對待測P450和UGT各酶亞型氨基酸序列進行分析和檢索，選擇理論上可代表各酶亞型的多個特征肽段； 采用高分辨質(zhì)譜LTQOrbitrap對肝微粒體酶解樣品進行測定[15]。根據(jù)樣品實際譜圖并參照特征肽段選擇基本原則[16]，確定能夠代表各酶亞型的特征肽段。以UGT1A1的特征肽段SVFDQDPFLLR為例，首先通過高分辨質(zhì)譜對肝微粒體樣品進行一級掃描 （圖1A）；然后對[M+2H]2+母離子（m/z 668.85）進行二級掃描和數(shù)據(jù)庫檢索[15]（圖1B），從而確定了肽段SVFDQDPFLL為UGT1A1的特征序列。

由于不同類型儀器產(chǎn)生的碎片離子豐度不同[17]，為更好地利用多反應監(jiān)測（MRM）模式對各酶亞型的特征肽段進行定量分析，需合成相應特征肽段的標準品進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。首先通過串聯(lián)質(zhì)譜母離子掃描確定響應值較高的母離子，如圖1C，確定用于定量分析的母離子m/z 669.1；選擇合適的能量，將母離子打碎；選擇響應值較高且穩(wěn)定的碎片離子，如圖1D，確定用于定量分析的子離子為m/z 645.5； 通過MRM實現(xiàn)對特征肽段的定量分析。

且可有效消除由基質(zhì)效應所帶來的誤差。如圖3所示，在甲酸溶液（0.1%）中，相同濃度的穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段色譜保留行為一致，穩(wěn)定同位素標記特征肽段與非標記特征肽段峰面積比值為1∶1.03， 響應值基本相同，因此可以利用穩(wěn)定同位素標記特征肽段作為內(nèi)標進行定量分析。由圖4可見，穩(wěn)定同位素標記特征肽段在含有基質(zhì)的M溶液中線性良好，能作為內(nèi)標進行定量分析。

3.4大鼠肝微粒體樣品的測定