李磊+林成仁+任建勛+苗蘭+姚明江+李丹+史躍+馬彥雷+付建華+劉建勛

摘要： 目的：觀察痰瘀同治方對(duì)痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬心功能的影響。方法：將36只中國小型豬隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、丹蔞片組和痰瘀同治方高、中、低劑量組（生藥2.0，1.0，0.5 g·kg^-1），每組6只；除對(duì)照組外，其他各組均給予高脂飼料喂養(yǎng)2周后，采用介入技術(shù)球囊損傷冠狀動(dòng)脈左前降支內(nèi)皮，術(shù)后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8周，制備小型豬痰瘀互結(jié)證冠心病模型；術(shù)后給藥8周，觀察心肌缺血程度的變化，并采用超聲心動(dòng)圖和無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)方法檢測心臟功能和結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組心肌缺血程度明顯增加，無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)中CO，SV和LCW均明顯降低，而SVR則明顯增加（P<0.05或P<0.01）；超聲心動(dòng)圖顯示IVSd，LVPWs，EF和FS明顯降低， LVIDs則明顯增加（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，痰瘀同治方能夠減少心肌缺血程度，增強(qiáng)心功能；改善缺血導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：痰瘀同治方對(duì)痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬心功能具有明顯的改善作用；采用臨床心功能的檢測方法能正確評(píng)價(jià)冠心病小型豬心肌缺血后心功能的改變，縮小臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究之間的差距。

關(guān)鍵詞： 痰瘀同治方；痰瘀互結(jié)證；冠心?。恢袊⌒拓i；心功能

[收稿日期] 2013-07-11

[基金項(xiàng)目] 國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2009ZX09502-017，2012ZX09301002-004）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81073085）

[通信作者] *劉建勛，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：liujx0324@sina.com

[作者簡介] 李磊，助理研究員，碩士，E-mail：lilei0502@126.com

中醫(yī)動(dòng)物模型是根據(jù)中醫(yī)理論，對(duì)人類疾病原型的某些病因病機(jī)特征進(jìn)行模擬復(fù)制，模擬出具有疾病和證結(jié)合特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。但是基礎(chǔ)研究的快速發(fā)展和臨床診療手段滯后的脫節(jié)現(xiàn)象，需要臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之間密切結(jié)合，相互促進(jìn)。采用臨床疾病的客觀評(píng)價(jià)手段對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行“擬臨床”評(píng)價(jià)是病證結(jié)合動(dòng)物模型研究的一個(gè)重要手段。這不僅可以促進(jìn)臨床檢查技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，而且能夠使基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究成果快速向臨床推廣和實(shí)施，體現(xiàn)了“轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)”的觀點(diǎn)。就心血管疾病的研究領(lǐng)域而言，如何將臨床心功能的評(píng)價(jià)和方法手段更好的應(yīng)用于心血管疾病的實(shí)驗(yàn)研究中，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)于臨床應(yīng)用更有價(jià)值和針對(duì)性，是目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。這不僅要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在解剖、生理與病理過程中與人類基本相符，同樣在檢查手段和方法中也應(yīng)更好地切合于當(dāng)前的心血管疾病評(píng)價(jià)的實(shí)際情況。本研究在前期課題組提出冠心病痰瘀互結(jié)病證結(jié)合動(dòng)物模型“擬臨床”研究的思想指導(dǎo)下^[1]，采用超聲心動(dòng)圖和無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)等技術(shù)評(píng)價(jià)具有祛痰行氣、活血化瘀功效的痰瘀同治方對(duì)痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬心功能的影響，為其臨床研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 中國實(shí)驗(yàn)小型豬（Chinese experimental miniature swine， CEMS），36只，雌雄不拘，體重15～20 kg，由北京北七家美樂養(yǎng)殖場提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2013-0005。

1.2 藥物與試劑 痰瘀同治方（TYTZ），主要由丹參、川芎、人參等中藥組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供；丹蔞片，0.3 g/片，由吉林康乃爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110601。戊巴比妥鈉，德國進(jìn)口分裝，北京化學(xué)試劑公司提供，批號(hào)020402； 76%復(fù)方泛影葡胺注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)071101；硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue， NT-B），美國Amresco公司；高脂飼料配方：每100 kg高脂飼料中含：膽固醇2 kg，膽鹽0.5 kg，豬油10 kg，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2009-0012。

1.3 儀器 MP150多導(dǎo)生理信息分析系統(tǒng)（美國Biopac公司）；BV Pulsera型C型臂X光機(jī)（荷蘭飛利浦公司）；BioZ心臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測儀（美國THE ICG公司）；快速交換PTCA球囊擴(kuò)張導(dǎo)管（管徑=1.3∶1，美國Boston公司）；導(dǎo)引導(dǎo)絲，6F Cordis血管造影導(dǎo)管和球囊，均由美國Abbott公司提供；ICE-CL31R低溫離心機(jī)（美國Thermo公司）；TEC-7621C型心電監(jiān)護(hù)儀（日本光電）；Vivid S5彩色超聲診斷儀（美國GE公司）；HMIAS-2000病理圖像分析系統(tǒng)（北京利金陽科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型的建立 依據(jù)文獻(xiàn)方法^[2]，采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷的方法建立痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型。具體方法：小型豬以高脂飼料喂養(yǎng)2周，每只每天900 g，在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)之上，用介入法行冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷。具體操作：耳靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg^-1）麻醉后，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，置入6F動(dòng)脈鞘管，從動(dòng)脈鞘管的側(cè)管注入肝素200 U·kg^-1。在C型臂X光機(jī)透視下，以6F 35 L右冠導(dǎo)引導(dǎo)管置于左冠狀動(dòng)脈開口行左冠狀動(dòng)脈造影，觀察豬冠狀動(dòng)脈的分布情況，造影后置入交換導(dǎo)絲，將導(dǎo)絲置入冠狀動(dòng)脈前降支（left anterior descending branch， LAD）中部，將球囊沿導(dǎo)絲進(jìn)入LAD中部。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間LAD血管直徑的差異進(jìn)行球囊加壓8～12大氣壓（atmosphere，ATM），持續(xù)30 s，反復(fù)3次，每次間隔1 min，間隔期間球囊不加壓，擴(kuò)張后維持球囊壓力4～6ATM，同時(shí)輕微拉動(dòng)球囊，距離約0.5～1.0 cm。完成后撤除導(dǎo)絲、球囊，再次造影觀察LAD擴(kuò)張情況，撤除導(dǎo)引導(dǎo)管，結(jié)扎頸總動(dòng)脈，傷口清創(chuàng)，局部給予150萬U青霉素，無菌縫合，單籠喂養(yǎng)觀察，術(shù)中連續(xù)心電監(jiān)護(hù)。術(shù)后繼續(xù)給予高脂飼料（每只每天900 g）喂養(yǎng)8周。所制備的動(dòng)物模型血脂水平升高，血液黏度增加，冠狀動(dòng)脈前降支動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯形成，心肌出現(xiàn)不同程度的缺血性改變，提示小型豬痰瘀互結(jié)證冠心病模型成功。正常對(duì)照組僅冠脈造影，不行介入損傷術(shù)，僅給予普通飼料喂養(yǎng)，每只每天900 g。endprint

2.2 分組及給藥 36只小型豬隨機(jī)分為6組（每組6只，雌雄不拘）：正常對(duì)照組、模型組、丹蔞片組（0.24 g·kg^-1）、痰瘀同治方高、中、低劑量組（生藥2.0，1.0，0.5 g·kg^-1）。術(shù)后第2天每天上午將藥物拌于飼料中喂養(yǎng)，連續(xù)給藥8周。

2.3 心肌NT-B染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（給藥后8周）放血處死動(dòng)物，立刻開胸取出心臟，生理鹽水沖洗，稱重，冠狀動(dòng)脈LAD狹窄部位以下，平行于冠狀溝處均勻地將心室部分切成5片，置于0.1% NT-B染液中，常溫、避光染色15 min，區(qū)分梗死區(qū)（NT-B非染色區(qū)）與非梗死區(qū)（NT-B染色區(qū)）。采用病理圖象分析系統(tǒng)描記梗死區(qū)心肌面積和心室面積，計(jì)算梗死區(qū)占心室（I/V）面積的百分?jǐn)?shù)。

2.4 無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（給藥后8周）應(yīng)用經(jīng)過改裝后的針式電極分別固定于小型豬的雙側(cè)頸部和肋下緣中點(diǎn)等8個(gè)部位，用于記錄無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括心輸出量（cardiac output， CO）、每搏輸出量（stroke volume， SV）、外周血管阻力（systemic vascular resistance， SVR）、左心做功（left cardiac work，LCW）等4項(xiàng)主要參數(shù)。以上血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別記錄于無創(chuàng)血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)。

2.5 超聲心動(dòng)圖 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（給藥后8周）進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。采用3S型心臟探頭，頻率1.5～2.6 MHz。小型豬麻醉后選取仰臥位，取左室長軸切面在二維超聲影像指導(dǎo)下用M型超聲分別測量室間隔舒張期厚度（IVSd）、左心室舒張期內(nèi)徑（LVIDs）、左室后壁收縮期厚度（LVPWs），計(jì)算心臟收縮功能指標(biāo)射血分?jǐn)?shù)（EF）及縮短分?jǐn)?shù)（FS）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示， 采用One-Way ANOVA （單因素方差分析）方法，方差齊性應(yīng)用 Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組動(dòng)物心肌缺血程度的變化 與對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物心肌出現(xiàn)明顯的缺血性變化（見箭頭），心肌梗死區(qū)明顯增加。與模型組比較，丹蔞片組和痰瘀同治方低、中、高劑量組動(dòng)物心臟梗死區(qū)/心臟，梗死區(qū)/心室比值均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。見圖1和表1。

3.2 各組動(dòng)物無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后（給藥后8周），與對(duì)照組比較，模型組CO，SV和LCW均明顯降低（P<0.01），而SVR則明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，痰瘀同治方中、高劑量組CO和LCW明顯升高而SVR明顯降低（P<0.05）。見表2。

CON.對(duì)照組；MOD.模型組；DL.丹蔞片組；TYTZ-H.痰瘀同治方高劑量組；TYTZ-M.痰瘀同治方中劑量組；TYTZ-L.痰瘀同治方低劑量組；箭頭所示心肌缺血部位。

圖1 各組動(dòng)物心肌缺血梗死面積

Fig.1 Animal myocardial ischemia and infarct size in different groups

3.3 各組動(dòng)物超聲心動(dòng)的改變 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后 （給藥后8周），各組超聲心動(dòng)圖顯示心功能出現(xiàn)差異。與對(duì)照組比較，模型組IVSd，LVPWs，EF和FS均明顯減少（P<0.05或P<0.01），而LVIDs明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，丹蔞片能夠明顯升高EF和FS值（P<0.05）；痰瘀同治方中、高劑量組LVPWs，EF和FS值明顯增加（P<0.05或P<0.01），而痰瘀同治方低劑量組具有改善心肌缺血小型豬超聲心動(dòng)圖的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

4 討論

轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)（translational medicine）是近年來國際醫(yī)學(xué)健康領(lǐng)域出現(xiàn)的新思想，即從實(shí)驗(yàn)室到病床（bench to bedside），再從病床到實(shí)驗(yàn)室（bedside to bench），實(shí)現(xiàn)“基礎(chǔ)-臨床”循環(huán)往復(fù)的研究模式，

簡稱為“B-to-B”^[3-4]。B-to-B模式不僅應(yīng)用于疾病的診斷與機(jī)制研究中，同樣也運(yùn)用于新藥研發(fā)當(dāng)中^[4-5]。而中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型“擬臨床”研究思路與方法是中醫(yī)理論實(shí)驗(yàn)研究在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)模式下的一個(gè)新的探索。病證結(jié)合“擬臨床”研究是近年來中西醫(yī)結(jié)合研究思路下提出的新觀點(diǎn)。首先模型動(dòng)物的選擇根據(jù)臨床需要，盡量選用與特定的人類解剖、生理和病理過程接近或類似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。第二，以臨床疾病客觀檢查方法為基礎(chǔ)，選用無創(chuàng)或微創(chuàng)的實(shí)驗(yàn)手段獲取有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即以臨床的手段來評(píng)價(jià)疾病模型各方面的改變。第三，不僅動(dòng)物模型誘導(dǎo)方法，而且疾病的病理演變過程都要求很好的符合臨床疾病發(fā)展變化過程^[6]。因此病證結(jié)合“擬臨床”研究的思路和方法不僅很好的體現(xiàn)了轉(zhuǎn)換醫(yī)學(xué)“基礎(chǔ)-臨床”往復(fù)的研究模式，而且促使中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究和中藥新藥實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)更加切合臨床，為臨床應(yīng)用提供更有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)。

通過前期冠心病痰瘀互結(jié)證的臨床研究，明確了冠心病痰瘀互結(jié)證候的表現(xiàn)特征及其相應(yīng)的客觀指標(biāo)主要體現(xiàn)在脂質(zhì)代謝障礙、凝血功能異常、血管功能改變以及炎癥反應(yīng)的激活等多個(gè)方面^[7]；本課題在冠心病動(dòng)脈粥樣硬化病理過程的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究之上，選擇與人類心血管系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)和生理最為相似的小型豬作為載體^[8]，以臨床冠心病常見危險(xiǎn)因素，如脂質(zhì)代謝紊亂，血管內(nèi)皮損傷作為誘導(dǎo)的主要方法，采用冠脈介入技術(shù)造成冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷復(fù)合高脂飼料長期喂養(yǎng)的方法建立冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬模型。不僅在證候評(píng)價(jià)中采用中醫(yī)證候診斷及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將包括主癥、兼癥、舌象、脈象在內(nèi)的四診信息對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行客觀化分級(jí)評(píng)分，模擬中醫(yī)臨床辨證^[9]；而且在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程中也體現(xiàn)出脂質(zhì)侵潤、血管壁斑塊形成、心肌缺血等病理變化特征，從痰瘀互結(jié)證和冠心病現(xiàn)代病理生理學(xué)過程2個(gè)不同的方面對(duì)其進(jìn)行很好的模擬。本研究在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄導(dǎo)致的心肌缺血、心功能下降的客觀評(píng)價(jià)中將臨床缺血后心功能評(píng)價(jià)方法應(yīng)用于冠心病中國小型豬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中。結(jié)果顯示，反映模型組動(dòng)物心臟結(jié)構(gòu)和功能的超聲心動(dòng)圖和無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)明顯異常，心室壁變薄和心腔擴(kuò)大，射血分?jǐn)?shù)和心排出量明顯下降。心肌梗死時(shí)心肌缺血的面積是決定心功能變化的主要因素，結(jié)合梗死后心肌N-BT染色進(jìn)一步證實(shí)前室壁和室間隔心肌部分梗死，梗死區(qū)擴(kuò)張變薄，不僅提示心肌缺血后出現(xiàn)心室重構(gòu)，心功能下降；而且提示采用臨床心臟超聲以及無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)的手段能夠很好的對(duì)中國小型豬冠心病心功能進(jìn)行檢測。在采用痰瘀同治方對(duì)痰瘀互結(jié)證冠心病小型豬模型進(jìn)行干預(yù)后，結(jié)果顯示痰瘀同治方可以明顯減少心肌梗死面積、改善心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、改善心功能，體現(xiàn)出心肌缺血程度、心臟結(jié)構(gòu)與心功能之間的關(guān)聯(lián)性。endprint

綜合上述，由于中國小型豬冠狀動(dòng)脈循環(huán)和生理與人接近，側(cè)枝循環(huán)的不足，心肌對(duì)缺血的耐受性較差，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊狹窄誘導(dǎo)心肌缺血后容易出現(xiàn)心功能的下降；以CO，SV和LCW，以及IVSd，LVPWs，EF和FS等心臟超聲和無創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)心功能客觀、真實(shí)、可靠，可比性強(qiáng)。通過臨床心臟結(jié)構(gòu)與功能分析檢查手段獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示痰瘀同治方對(duì)冠心病痰瘀互結(jié)證中國小型豬心功能具有明顯的改善作用，對(duì)該藥進(jìn)一步的冠心病痰瘀互結(jié)證臨床研究具有積極意義。因此“擬臨床”病證結(jié)合動(dòng)物模型建立及對(duì)證治療藥物療效的評(píng)價(jià)方法是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)模式與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)相結(jié)合的體現(xiàn)，值得進(jìn)一步推廣和研究。

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Effect of formula of removing both phlegm and blood stasis in improving

cardiac function of Chinese mini-swine with coronary heart disease of

phlegm-stasis cementation syndrome

LI Lei， LIN Cheng-ren， REN Jian-xun， MIAO Lan， YAO Ming-jiang， LI Dan， SHI Yue， MA Yan-lei，

FU Jian-hua， LIU Jian-xun*

（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing Key Laboratory of Chinese Materia Pharmacology， Beijing 100091， China）

[Abstract] Objective： To evaluate that the effect of formula of removing both phlegm and blood stasis in improving cardiac function of Chinese mini-swine with coronary heart disease of phlegm-stasis cementation syndrome. Method： Totally 36 Chinese mini-swine were randomly divided to six groups： the normal control group， the model group， the Danlou tablet group， and Tanyu Tongzhi Fang（TYTZ） groups with doses of 2.0， 1.0 and 0.5 g·kg^-1， with six in each group. Except for the normal control group， all of other groups were fed with high-fat diet for 2 weeks. Interventional balloons are adopted to injure their left anterior descending artery endothelium. After the operation， they were fed with high-fat diet for 8 weeks to prepare the coronary heart disease model of phlegm-stasis cementation syndrome. After the operation， they were administered with drugs for 8 weeks. The changes in the myocardial ischemia were observed. The changes in the cardiac function and structure were detected by cardiac ultrasound and noninvasive hemodynamic method. Result： Compared with the normal control group， the model group showed significant increase in myocardial ischemia and SVR and obvious decrease in CO， SV and LCW in noninvasive hemodynamic parameters （P<0.05 or P<0.01）. The ultrasonic cardiogram indicated notable decrease in IVSd， LVPWs， EF and FS， and remarkable increase in LVIDs （P<0.05 or P<0.01）. Compared with the model group， TYTZ could reduce the myocardial ischemia， strengthen cardiac function， and improve the abnormal cardiac structure and function induced by ischemia （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion： TYTZ shows a significant effect in improving cardiac function of Chinese mini-swine with coronary heart disease of phlegm-stasis cementation syndrome. The clinical cardiac function detection method could be adopted to correctly evaluate the changes in the post-myocardial ischemia cardiac function， and narrow the gap between clinical application and basic experimental studies.

[Key words] formula of removing both phlegm and blood stasis； phlegm-stasis cementation syndrome； coronary heart disease； Chinese mini-swine； cardiac function

doi：10.4268/cjcmm20140323

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint