張明華+封亮+顧俊菲+蔣俊+賈曉斌

摘要： 目的：探討牡丹皮對晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增生及基底膜增厚的影響。方法：建立AGEs誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞（MC）損傷模型，設(shè)置空白組[牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），200 mg·L^-1]，模型組（AGEs，200 mg·L^-1），氨基胍（aminoguanidine，AG）陽性組（10 mmol·L^-1），牡丹皮高、中、低劑量組（2×10-4，1×10-4，0.5×10-4 g·mL^-1）。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法觀察牡丹皮對損傷的MC的增殖影響；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定細(xì)胞上清液中纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和Ⅳ膠原蛋白（type Ⅳ collagen secretion，ColⅣ）的含量；采用Western blotting觀察FN的表達(dá)；Real-time PCR檢測Col Ⅳ的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：牡丹皮能抑制AGEs刺激的MC增殖以及FN和Col Ⅳ分泌；Western blotting表明牡丹皮下調(diào)MC分泌的FN表達(dá)；Real-time PCR結(jié)果說明牡丹皮對AGEs刺激下的MC分泌Col Ⅳ的mRNA表達(dá)有下調(diào)作用。結(jié)論：牡丹皮對AGEs培養(yǎng)條件下的MC具有一定的保護(hù)作用，牡丹皮能明顯抑制基質(zhì)中Col Ⅳ及FN的合成與分泌，抑制基底膜增厚，為糖尿病腎病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 牡丹皮；晚期糖基化產(chǎn)物；系膜細(xì)胞；基底膜增厚；纖維連接蛋白；Ⅳ膠原蛋白

[收稿日期] 2013-06-03

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202906）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012491）

[通信作者] *封亮，E-mail： wenmoxiushi@163.com；*賈曉斌，教授，研究員，博士生導(dǎo)師，Tel：（025）85608672，E-mail： jxiaobin2005 @hotmail.com

[作者簡介] 張明華，碩士研究生，E-mail：jdyx0701.111@163. com

牡丹皮（Moutan Cortex）為毛茛科芍藥屬植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效。隨著研究的不斷深入，牡丹皮已證明具有廣泛的抗炎^[1-2]，抗氧化^[3]等作用，是治療心血管疾病的傳統(tǒng)中藥^[4-5]。糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一， 是造成終末期腎衰的主要病因。其病理特征主要包括腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)堆積^[6-7]，其中系膜細(xì)胞（mesangial cell，MC）過度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的過度生成和聚積是腎小球硬化早期的病理改變^[8]。研究表明晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）廣泛聚集于腎小球基底膜以及腎系膜細(xì)胞上，在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用^[9]。當(dāng)AGEs與其特異性受體RAGE結(jié)合后，腎小球受到損傷刺激，造成系膜細(xì)胞的活化、增殖，細(xì)胞基質(zhì)的分泌，使基底膜增厚，最終誘導(dǎo)糖尿病腎病^[10-11]。本實(shí)驗(yàn)主要研究牡丹皮對AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增生及基底膜增厚的影響，通過體外AGEs誘導(dǎo)的MC損傷模型，研究丹皮對MC的生長以及細(xì)胞內(nèi)纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N），Ⅳ膠原蛋白（type Ⅳ collagen secretion，Col Ⅳ）的含量的影響，探討牡丹皮調(diào)節(jié)基底膜增厚的作用，為糖尿病腎病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 貝克曼高速冷凍離心機(jī)（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERA CELL 500，Thermo Forma公司）；生物安全柜（LABCONCO PURIFIER CLASS Ⅱ BIOSAFETY CABINET）；倒置顯微鏡（Nikon Eclipse TS100）；全自動酶標(biāo)儀（Thermo）；Anke TDL-40B型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品）；ZW-A型微量振蕩器（常州國華電器有限公司）；熒光定量PCR循環(huán)儀（美國ABI Step one plus Real-time PCR system）；DYY-6B核酸電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（美國 BIO-RAD Gel Doc XR）；GZX-DH400-S電熱恒溫干燥箱（上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；紫外-ZXC 型紫外消毒車（江蘇巨光光電科技有限公司） 。

1.2 藥材 牡丹皮飲片（購自安徽亳州，安徽滬譙中藥有限公司，批號20120415，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳德康教授鑒定為芍藥屬牡丹P. suffruticosa）。經(jīng)高效液相色譜含量測定顯示，本實(shí)驗(yàn)用藥材含丹皮酚2.02%，符合藥典規(guī)定的不少于1.2%的標(biāo)準(zhǔn)。稱取牡丹皮飲片約100 g，加入500 mL乙醇，加熱回流1 h，收集提取液，藥渣再次回流，合并提取液，回收乙醇。貝克曼高速離心機(jī)離心，控制轉(zhuǎn)速5 000 r·min^-1離心15 min，取上清。

1.3 細(xì)胞動物與試劑 HBZY-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。不完全DMEM（低糖）培養(yǎng)基（南京凱基生物工程研究所）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，羅氏制藥）；氨基胍（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20120716）；FN，Ⅳ型膠原ELISA 試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）；FN抗體（南京生興生物科技有限公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所，編號P0013C）；Trizol（美國Invitrogen 15596-026）；cDNA第一鏈合成試劑盒（美國 Thermo Fisher K1622）；Taq DNA Polymerase（美國 Thermo Fisher EP0405）；Real-time PCR Master Mix（SYBR Green）（日本 TOYOBO）；Agarose（西班牙Biowest 111860）；50×TAE電泳緩沖液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國 KGM020）；0.25%的胰蛋白酶液（美國GIBCO公司產(chǎn)品） 。endprint

2 方法

2.1 AGEs的孵育 精密稱取5 g牛血清白蛋白（BSA） 和9 g D-葡萄糖，加入100 mL無菌的玻璃容器中，以0.2 mol·L^-1磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2） 100 mL溶解。溶解液過0.22 μm濾膜過濾。密封狀態(tài)于37 ℃下孵育3個月。取出棕色反應(yīng)液，在PBS溶液中透析除去小分子化合物，獲得糖基化終產(chǎn)物（AGEs）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MC細(xì)胞接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，以不完全DMEM（低糖）培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，置于37 ℃， 95%空氣5%CO2濃度培養(yǎng)箱中，每2 d更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞長至80%～90%融合度時，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞給藥及病理模型的建立 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，孵育24 h，棄去培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)時設(shè)空白組：牛血清白蛋白（10 μmol·L^-1）；模型組：AGEs（200 mg·L^-1）；陽性組：AG（10 μmol·L^-1） +AGEs （200 mg·L^-1）；高劑量組：丹皮（2×10-4 g·mL^-1）+AGEs （200 mg·L^-1）；中劑量組：丹皮（1×10-4 g·mL^-1）+AGEs（200 mg·L^-1）；低劑量組：丹皮（0.5×10-4 g·mL^-1）+AGEs（200 mg·L^-1）。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取上清以供ELISA實(shí)驗(yàn)測定。

2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期系膜細(xì)胞，消化后制成單個細(xì)胞懸液，按5×104個/mL密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液；細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次。實(shí)驗(yàn)設(shè)置給藥方法同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL MTT液（5 g·L^-1），培養(yǎng)4 h，棄去每孔中的液體，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min后置于490，570 nm波長酶標(biāo)儀測定吸光度。

2.5 Col Ⅳ及FN 的含量檢測 取各組細(xì)胞上清液，采用ELISA試劑盒測定，按照說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀下450 nm處測定各組吸光度，計(jì)算得出Col Ⅳ及FN的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。

2.6 蛋白提取及Western blotting檢測FN蛋白表達(dá) 細(xì)胞用冰PBS洗后，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下15 000 r·min^-1離心3 min，收集上清，測蛋白濃度。取等量總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳，將蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，BSA封閉，加入FN（1∶400）抗體孵育過夜，加入二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色。

2.7 總RNA提取及Real-time PCR檢測Col Ⅳ mRNA 系膜細(xì)胞加入1 mL預(yù)冷的Trizol提取RNA。取RNA樣品，測定樣品在260，280 nm的吸收度確定總RNA濃度，取2 μg RNA合成cDNA，產(chǎn)物濃度調(diào)整為100 mg·L^-1。PCR體系引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，采用Primer5Sense primer軟件設(shè)計(jì)，Col Ⅳ：正義引物5′-GTCAGCAATTAGGCAGGTCAAGT-3′，反義引物5′-AGTGAGTGAGAAAGGCTGGTGTT-3′，產(chǎn)物長度151 bp；GAPDH：正義引物5′-TGTTGCCATCAACGACCCCTT-3′，反義引物5′-CTCCACGACATACTCAGCA-3′，產(chǎn)物長度202 bp。熒光曲線上讀出Ct值（即熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值所需的循環(huán)數(shù)），用2-ΔΔCt法計(jì)算各因子mRNA的相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采用GraphPad PrismTM 5.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 牡丹皮對系膜細(xì)胞增殖的影響 與空白組（0.48±0.03）相比較，模型組經(jīng)AGEs刺激后的吸光度明顯升高（0.65±0.01，P<0.001），說明AGEs能顯著誘導(dǎo)MC的增殖。與陽性藥物AG相同，丹皮各組吸光度均低于模型組（P<0.001）， 且隨著濃度的增加吸光度降低，僅低濃度組與其比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明牡丹皮能抑制MC增殖，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系（圖1）。

A. 空白組；B. 模型組；C. 陽性藥物組；D. 高劑量組；E. 中劑量組；F. 低劑量組；與空白組比較1）P<0.001；與模型組比較2）P<0.001，3）P<0.01，4）P<0.05（圖2～5同）。

圖1 牡丹皮對系膜細(xì)胞增殖的影響

Fig.1 Effect of Moutan Cortex on mesangial cell proliferation

3.2 牡丹皮對系膜細(xì)胞產(chǎn)生FN的影響 在AGEs刺激下，F(xiàn)N含量與空白組比較顯著增加（P<0.001）。然而，與模型組相比，F(xiàn)N的含量能被陽性藥物AG顯著降低（P<0.01）。低劑量牡丹皮對FN含量降低作用不明顯，但高劑量（P<0.001）和中劑量（P<0.01）牡丹皮作用后，F(xiàn)N水平較空白組顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性（圖2）。在采用Western blotting法對細(xì)胞中FN蛋白表達(dá)量檢測時，發(fā)現(xiàn)不同濃度的牡丹皮可使其FN蛋白表達(dá)量降低（與模型組比較），且具有劑量依賴性，對其結(jié)果進(jìn)行灰度掃描和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明牡丹皮能明顯抑制MC分泌FN。endprint

圖2 牡丹皮對系膜細(xì)胞上清FN含量的影響

Fig.2 Effect of Moutan Cortex on FN content in supernatant of mesangial cell

圖3 牡丹皮對系膜細(xì)胞FN蛋白表達(dá)的影響

Fig.3 Effect of Moutan Cortex on FN protein expression in mesangial cells

3.3 牡丹皮對系膜細(xì)胞產(chǎn)生Col Ⅳ的影響 通過ELISA法對MC細(xì)胞上清液的含量測定，結(jié)果顯示空白組Col Ⅳ的分泌量很少，模型組經(jīng)AGEs刺激后，Col Ⅳ的分泌量顯著增加，與空白組相比有極顯著性差異（P<0.001）。牡丹皮高、中劑量組Col Ⅳ的分泌量均減少，與模型組相比差異顯著（P<0.05），低劑量組無明顯抑制作用（圖4）。

Real-time PCR結(jié)果顯示（圖5）：AGEs刺激后的模型組中Col Ⅳ的mRNA表達(dá)水平高于空白組，陽性藥物AG和不同濃度牡丹皮作用后，Col Ⅳ的mRNA表達(dá)與模型組比較均有不同程度的下降（P<0.001），且隨著牡丹皮濃度的增大，Col Ⅳ的mRNA表達(dá)存在下降趨勢。研究結(jié)果說明牡丹皮能抑制MC分泌Col Ⅳ。

圖4 牡丹皮對系膜細(xì)胞上清Col Ⅳ含量的影響

Fig.4 Effect of Moutan Cortex on Col Ⅳ content in supernatant of mesangial cell

圖5 牡丹皮對系膜細(xì)胞Col Ⅳ mRNA表達(dá)的影響

Fig.5 Effect of Moutan Cortex on Col Ⅳ mRNA expression in mesangial cells

4 討論

足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞是構(gòu)成腎小球的3種主要細(xì)胞^[12]。報告顯示，在糖尿病腎病的形成中，系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞中反應(yīng)最活躍的細(xì)胞中，起著重要的作用^[13]。當(dāng)系膜細(xì)胞受到外源性AGEs刺激時，系膜細(xì)胞的自分泌、旁分泌機(jī)制作用增強(qiáng)，參與腎臟的炎癥性損傷，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展^[14]。AGEs可使系膜細(xì)胞可發(fā)生異常增殖，腎小球基底膜成分交聯(lián)增多，基底膜增厚，促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖或肥大，同時伴有ECM的積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化或小管間質(zhì)纖維化^[15-16]。

ECM由FN，Ⅳ型膠原等多種成分組成，F(xiàn)N是ECM的主要成分。在炎癥條件下，F(xiàn)N可由系膜細(xì)胞分泌產(chǎn)生，隨細(xì)胞增殖而分泌增多^[17]。同時，F(xiàn)N對介導(dǎo)細(xì)胞增殖和其他的ECM成分的沉積也起到重要的作用^[18]。Ⅳ膠原蛋白是ECM主要膠原組成，是構(gòu)成腎小球基膜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的支架，其合成分泌的異常，則會導(dǎo)致Ⅳ型膠原在腎小球內(nèi)的異常積聚，使腎基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)ECM積聚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化^[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)研究牡丹皮對AGEs刺激的系膜細(xì)胞增生及基底膜增厚的影響。研究表明，在AGEs刺激后，系膜細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，與文獻(xiàn)報道一致。此外，F(xiàn)N，Ⅳ型膠原的含量明顯增加。而牡丹皮能抑制AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖以及FN，Ⅳ型膠原的積累，且作用具有劑量依賴關(guān)系。此研究結(jié)果說明牡丹皮對AGEs誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增生及基底膜增厚具有較顯著的影響，為糖尿病腎病研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Moutan Cortex on AGEs-induced mesangial cell

proliferation and basement membrane thickening

ZHANG Ming-hua1， 2， FENG Liang2*， GUN Jun-fei2， JIANG Jun2， JIA Xiao-bin1， 2*

（1. School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China；

2. Key Laboratory of Drug Delivery System of Chinese Materia Medica under State Administration of

Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China）

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Moutan Cortex on mesangial proliferation and basement membrane thickening induced by advanced glycation end products （AGEs）. Method： The glomerular mesangial cells （MC） injury model was established by inducing by AGEs. The cell were divided into 6 groups： the blank group （BSA， 200 mg·L^-1）， the model group （AGEs， 200 mg·L^-1）， the positive control group （AG， 10 mmol·L^-1）， and drug administration groups， namely the Moutan Cortex-treated high-dose group （2×10-4 g·mL^-1）， the Moutan Cortex-treated medium-dose group （1×10-4 g·mL^-1）， and the Moutan Cortex-treated low-dose group （0.5×10-4 g·mL^-1）. The MTT method was performed to observe the effect of Moutan Cortex on the proliferation of MC. The content of fibronectin （FN） and collagen secretion Ⅳ （Col Ⅳ） in cell supernatant were detected by ELISA kits. The western blot analysis was carried out to observe the FN expression. The Real-time PCR analysis was applied to examine the Col Ⅳ mRNA expression. Result： AGEs significantly increased AGEs-induced MC proliferation and FN and Col Ⅳ secretion. The western blot analysis showed that MC could down-regulate the FN expression of MC secretion. According to the results of the real-time PCR assay， MC could down-regulate AGEs-induced MC secretion Col Ⅳ mRNA expression. Conclusion： MC had a certain protective effect on MC cultured under AGEs conditions. MC could remarkably inhibit the composition and secretion of Col Ⅳ and FN in matrix and the basement membrane thickening， and provide an experimental basis for the treatment of diabetic nephropathy.

[Key words] Moutan Cortex； advanced glycation end product； mesangial cell； basement membrane thickening； fibronectin； collagen secretion Ⅳ

doi：10.4268/cjcmm20140322

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint