陳 盛，金 燕，劉綠葉，*

（1．浙江省臺州市質量技術監(jiān)督檢測研究院，浙江臺州318000；2．賽默飛世爾科技中國有限公司，上海201203）

在線SPE液質聯(lián)用法分析原料糖漿中2-氨基乙酰苯

陳 盛1，金 燕2，劉綠葉2，*

（1．浙江省臺州市質量技術監(jiān)督檢測研究院，浙江臺州318000；2．賽默飛世爾科技中國有限公司，上海201203）

建立了一種采用在線SPE對糖漿中的2-氨基乙酰苯進行了富集、濃縮與去除有機雜質干擾樣品前處理方式，同時采用高效液相色譜與質譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS）對樣品中2-氨基乙酰苯（2-AP）進行了準確定性與定量分析的方法。在線SPE柱：采用100%親水的Acclaim PA柱（4.0mm×30mm，5.0μm），分析柱采用ODS柱（2.1mm×150mm，3.0μm）；質譜方法，采用ESI源選擇反應離子監(jiān)測（SRM）模式，自動優(yōu)化了S-Lens、CE等參數(shù)。結果表明：該方法的線性回歸方程Y=-12123.6+33480.1X，相關系數(shù)r為0.9999，線性范圍為0.3～150ng/mL，進樣體積10.0μL，檢出限（以S/N=3計）為0.03ng/mL，樣品加標回收率達93%以上。采用該方法對3份不同的生產(chǎn)工藝糖漿樣品進行了分析，結果表明均小于儀器檢出限。

2-氨基乙酰苯，在線SPE，液質聯(lián)用，糖漿

2-氨基乙酰苯（2-aminoacetophenone，簡寫為2-AP），是許多食品（如葡萄酒、果葡糖漿）中經(jīng)常出現(xiàn)的一種重要的、具有芳香活性的微量物質，化學結構式如圖1所示。1993年，人們發(fā)現(xiàn)含有2-AP的白葡萄酒中經(jīng)常會出現(xiàn)一種類似于衛(wèi)生球、地板漆、濕羊毛或者是雜醇酒精的口味，當酒中的2-AP濃度超過了某個感官閾值時，就會造成所謂“非典型老化（untypical aging）”的不良風味，簡稱為“UTA”現(xiàn)象，這種UTA現(xiàn)象的存在會嚴重影響葡萄酒的口感和風味。后來也有文獻記錄2-AP有可能存在于果葡糖漿中，導致了果葡糖漿產(chǎn)生UTA現(xiàn)象，影響產(chǎn)品正常的風味和口感[1-3]。因此，對于廣大的果葡糖漿生產(chǎn)企業(yè)而言，2-AP的含量是一項必須的檢測項目，以便能更好地預防控制和減少2-AP產(chǎn)生，以提高產(chǎn)品質量，滿足市場需求。

2-氨基乙酰苯的檢測方法有多種，由于其含有苯環(huán)（見圖1），有較強的紫外吸收，且極性較弱，比較適合于反相液相色譜分離。ISBT方法[4]規(guī)定使用液相色譜紫外檢測器對該化合物進行了分析，進樣體積300μL，檢測波長220nm，但該方法由于采用進樣體積較大，且在低波長測定，使得基質干擾較為嚴重，不能進行準確的定性與低含量的定量分析。Fan等[5]建立了浸入式固相微萃取法（DISPME）和GC-MS聯(lián)用法對2-AP進行了快速檢測，采用內(nèi)標法定量。整個分析時間需要約為40min，檢測限為0.5～1.0μg/L，該方法分析時間較長，且前處理耗材使用的成本較高。因此，本文采用了在線SPE液質聯(lián)用法對2-AP進行了分析。采用在線SPE方法對樣品進行了富集與基質去除，前處理更為快速；同時，采用了液相色譜與三重四極桿質譜聯(lián)用的方法，在反相條件下對2-AP與糖漿中的雜質進行了分離，選擇反應離子監(jiān)測模式進行了準確的定性與低含量的定量檢測。該方法具有快速，易操作，方便，重復性好，檢測限低等的特點，適合用于糖漿中2-AP的分析，對相關企業(yè)質量控制標準及科研分析工作者具有一定的參考和借鑒意義。

圖1 2-氨基乙酰苯分子結構式Fig.1 Molecular structure of 2-aminoacetophenone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糖漿 來自某糖漿生產(chǎn)企業(yè)（批號分別為：20130201、20130301、20130401）；乙腈、甲醇、甲酸HPLC級，Thermo Fisher Scientific公司；2-氨基乙酰苯（CAS號：5468-37-1） 標準品（純度99.8%），Sigma-Aldrich公司；超純水 美國Millipore公司；其他未注明試劑 均為分析純。

UltiMate 3000超高效液相色譜儀 Thermo Fisher Scientific公司，美國，主要配制：泵（內(nèi)置脫氣機，集成了左、右兩個泵），型號：DGP-3600RS；自動進樣器，型號：WPS-3000TSL（帶自動清洗針功能）；TCC-3000RS柱溫箱 裝有一個六通閥；TSQ Vantage三重四極桿質譜儀 Thermo Fisher Scientific公司，美國；色譜工作站 Chromeleon 6.8 SR10；質譜工作站Xcalibur 2.2；根據(jù)以上儀器模塊，配制成在線SPE液質聯(lián)用模式，示意圖見圖2。

1.2 樣品與標準品處理

圖2 在線SPE液質聯(lián)用示意圖Fig.2 The figure of online SPE HPLC-MS/MS

樣品前處理：精確稱取樣品3.0g，放入10mL進樣瓶中，用含2%H3PO4的超純水定量到10mL，在100℃下加熱5min后，待冷卻至室溫，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，裝瓶并待測。

標準溶液的配制：精確稱取2-AP標準物質的質量0.300g于100mL容量瓶中，加入25mL HPLC級乙腈，用超純水定容至刻度，搖勻后制成0.300mg/L的標準儲備液。然后用超純水逐級稀釋分別得到0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL標準品，分別經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后裝瓶，待測。

1.3 實驗條件與方法

色譜條件：分析柱：Acclaim 120 C18（2.1mm× 150mm，3.0μm）；在線SPE柱：Acclaim PA C16（4.0mm× 30mm，5.0μm）。流動相為乙腈與0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，其中，右泵提供分析柱洗脫流動相，左泵提供SPE分析洗脫流動相，見表1。進樣體積：10.0μL。

質譜條件：ESI源，正離子模式，霧化溫度：450℃，干燥氣：2.06×105Pa，輔助氣：3.44×105Pa，霧化電壓：3.0KV。定性定量掃描模式：選擇反應離子監(jiān)測（SRM），碎片離子1：m/z 136.0～91.1，CE 24V；S-lens：56.0；碎片離子2：m/z 136.0～118.1，CE 14V；S-lens：56.0；碎片離子3：m/z 136.0-65.1 CE 36V；S-lens：56.0，其中碎片離子1為定量離子。

在線SPE六通閥切換時間：0min，閥位置1-2，SPE柱上樣；2.2min，閥位置6-1，SPE柱洗脫；3.5min，閥位置1-2，SPE柱平衡/再生，分析柱開始分析。

表1 流動相梯度洗脫條件Table.1 The gradient elution condition of mobile phase

2 結果與討論

2.1 在線SPE選擇及質譜條件優(yōu)化

在線SPE條件選擇：本方法參考了相關在線SPE文獻方法[6-7]，采用了更為親水的C16小柱做為SPE柱，在0～2.2min內(nèi)，糖漿樣品中的親水性基質化合物，被洗脫入廢液，而在2.2～3.5min，2-AP被洗脫下來，經(jīng)過六通閥切入分析柱ODS柱中，3.5min后，SPE小柱進入再生模式，而分析柱開始進入梯度洗脫分析。因此，該步驟去除掉了樣品中的基質以及前處理樣品使用到的磷酸溶液等。

質譜條件優(yōu)化：通過Xcalibur質譜工作站，分別自動優(yōu)化了S-lens，碰撞能量（CE），以及離子源霧化參數(shù)，最終選擇了三對碎片離子進行監(jiān)測分析。

表2 樣品加標回收率結果Table.2 The results of recovery of spiked samples

2.2 標準溶液譜圖及線性關系

參考“1.3”項中的條件與方法，分別對0.3、3.0、15.0、30.0、150.0ng/mL標準溶液進樣10.0μL，譜圖見圖3（以0.5ng/mL為例），以質譜信號強度（Intensity）與峰寬（min）的乘積即峰面積為縱坐標Y，2-氨基乙酰苯濃度（ng/mL）為橫坐標X，進行線性擬合，得線性回歸方程為：回歸方程為Y=-12123.6+33480.1X，相關系數(shù)r為0.9999，如圖4所示。

圖3 2-氨基乙酰苯標準品色譜圖Fig.3 Chromatogram of 2-AP standard solution

圖4 2-氨基乙酰苯標準曲線圖Fig.4 Standard curve of 2-AP

2.3 精密度實驗

對15.0ng/mL標準溶液進行了分析，連續(xù)進樣了6針（進樣體積10.0μL），保留時間（RT）為7.76min；峰面積平均值為538625，相對標準偏差（RSD）值為4.5%，重現(xiàn)性較好。

2.4 樣品加標回收率實驗

取空白樣品3份，加入標準溶液適量，按照“1.3”項下色譜質譜條件進行測定（每份測定3次），根據(jù)外標法計算結果，然后計算回收率，結果見表2，回收率在93.3%～102.0%之間，回收率較好。

2.5 儀器檢出限

分析了標準溶液最低濃度點0.03ng/mL，進樣體積為10μL，其信噪比達到3.0以上。因此，得出對2-氨基乙酰苯的儀器最低檢出限（LOD，以S/N=3計），達到0.03ng/mL。

2.6 實際樣品含量測定

對某生產(chǎn)企業(yè)提供的三份糖漿樣品分別進行了兩次平行測定，結果均小于儀器的檢出限。

3 結論

通過對TSQ vantage質譜參數(shù)的優(yōu)化，同時采用online SPE在線富集濃縮的技術，具有三個優(yōu)點：a.可以去除干擾，如原料糖中的糖漿，還有提取用的磷酸；b.可以降低檢出限，最終達到0.03ng/mL；c.采用在線SPE技術比離線處理更快，重現(xiàn)性更好。因此，該方法適合用于糖漿或釀酒行業(yè)對2-氨基乙酰苯的分析要求，具有一定的推廣與借鑒意義。

[1]許世楓，黃立新，徐正康.果葡糖漿中的2-氨基乙酰苯及其檢測方法綜述[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：110-113.

[2]Katrin Hoenicke，Thomas J Simat，Hans Steinhart.Untypical aging off-flavor in wine：formation of 2-aminoacetophenone and evaluation of its influencing factors[J].Analytica Chimica Acta，2002，458：29-37.

[3]Ron G Buttery，Louisa C Ling.Importanceof2-aminoacetophenone to the flavor of masa corn flour products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，4（1）：1-4.

[4]ISBT 14.0-2003.2-Aminoacetophenone（2-AP）[S].

[5]Wen1ai Fan，I-Min Tsai，Michae1 C Qian．Analysis of 2-aminoacetophenone by direct-immersion solid phase micro extraction and gas chromatography-mass spectrometry and its sensory impact in Chardonnay and Pinot gris wines[J]．Food Chemistry，2007，19（2）：1-23.

[6]郭娟，趙研，張晶.飲用水中的9種農(nóng)藥殘留及微囊藻毒素的在線固相萃取-液相色譜-質譜法測定[J].衛(wèi)生研究，2012，41（2）：235-238.

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Determination of 2-aminoacetophenone in syrup by online SPE HPLC-MS/MS

CHEN Sheng1，JIN Yan2，LIU Lv-ye2，*
（1.Taizhou Institution of Quality and Technical Supervision and Inspection，Taizhou 318000，China；2.Thermofisher Scientific Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China）

An analytical method for determination of 2-aminoacetophenone in different Syrup by online SPE and HPLC MS/MS was developed which online SPE could enrich the target and remove the interference and HPLC-MS/MS could determine and quantitate of 2-aminoacetophenone.The SPE column was Acclaim PA（4.0mm×30mm），and the analytic column was ODS（2.1mm×150mm，3.0μm），and the Mass Spectrometry’s parameters（S-lens，CE，etc.）were automatic optimization with SRM mode.The results showed that the calibration formula was Y=-12123.6+33480.1X，the correction coefficient was above 0.9999，and the calibration curve was linear in the range of 0.3～150ng/mL，injection volume was 10.0μL and the detection limit of the method（with S/N=3）was 0.03ng/mL，the recoveries of spiked samples were more than 93%.Then 3 different samples were analyzed with this method，the contents were not detected.

2-ainoacetophenone；online SPE；HPLC MS/MS；syrup

TS247

A

1002-0306（2014）04-0076-03

2013－07－30 *通訊聯(lián)系人

陳盛（1983-），男，碩士研究生，研究方向：食品的檢測技術研發(fā)和質量管理。