李雙紅，劉永峰，韓裕睿，趙露華，袁 爽

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

不同胎次奶牛乳中乳蛋白含量的近紅外光譜定量分析

李雙紅，劉永峰*，韓裕睿，趙露華，袁 爽

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

對不同胎次奶牛的牛奶樣品進(jìn)行近紅外光譜掃描，并用多功能乳制品分析儀對牛奶樣品中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測定。利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別采用主成分回歸法（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、改進(jìn)偏最小二乘法（MPLS）三種定量校正方法和多種光譜預(yù)處理方法建立模型，利用目標(biāo)函數(shù)法對模型進(jìn)行評定，結(jié)果表明：一胎、二胎奶牛乳樣中乳蛋白的最優(yōu)模型相同，其校正相關(guān)系數(shù)（R2）、定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差（SEC）和預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）分別為：0.9626、0.0531、0.0630和0.9377、0.0810、0.1100；建立了三胎及以上奶牛乳樣中乳蛋白的最優(yōu)模型，R2、SEC和SEP分別為：0.9406、0.0461和0.0500；同時，建立了所有乳樣中乳蛋白的最優(yōu)模型，R2、SEC和SEP分別為：0.9351、0.0687和0.0790。所建模型對于快速、準(zhǔn)確、無損、定量檢測原料奶中乳蛋白的含量是可行的，該方法為快速檢測混合原料奶中乳蛋白含量提供了理論依據(jù)。

乳蛋白，近紅外光譜，定量分析，胎次

牛乳所含營養(yǎng)成分齊全，組成比例適宜，近年來已經(jīng)成為人們飲食的重要組成部分[1]。牛乳的營養(yǎng)成分中，蛋白質(zhì)的含量是衡量牛乳質(zhì)量的核心指標(biāo)之一。影響乳中的乳蛋白含量的因素很多，有奶牛胎次、品種、泌乳階段、產(chǎn)奶量、飼養(yǎng)方式等。據(jù)報(bào)道，不同胎次奶牛乳樣中乳蛋白含量明顯不同[2]。熊本海等[3]研究了中國奶牛乳成分及相關(guān)指標(biāo)隨季節(jié)和胎次變化的規(guī)律。Moore等[4]研究了胎次與乳中免疫球蛋白的含量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)奶牛三胎乳中免疫球蛋白含量高于一胎牛乳。Hagiwara等[5]研究發(fā)現(xiàn)一胎與二胎奶牛的乳鐵蛋白含量差異不顯著，而第三胎時乳鐵蛋白含量顯著下降（p＜0.05），且隨著產(chǎn)犢的增加乳鐵蛋白含量呈不斷下降趨勢?？梢姡瑢τ谠夏讨械鞍踪|(zhì)含量的測定備受廣大乳品企業(yè)關(guān)注。

目前原料乳及乳制品中的蛋白質(zhì)主要是通過傳統(tǒng)的化學(xué)方法測定，而像近紅外光譜分析方法（NIRS）這類快速、準(zhǔn)確、無損的檢測技術(shù)應(yīng)用較少，但其現(xiàn)實(shí)意義重大[6]。NIRS利用物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)內(nèi)的光學(xué)特性[7]，快速測定樣品成分含量。雖然國內(nèi)很多學(xué)者已將NIRS廣泛運(yùn)用于牛奶中主要成分含量的測定分析[8-11]。但是，將NIRS與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合定量分析不同胎次奶牛乳中乳蛋白成分含量的研究還少見報(bào)道。因此，本研究借助近紅外光譜技術(shù)，將正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于研究不同的光譜預(yù)處理和定量校正過程中，分別建立不同胎次奶牛乳中乳蛋白的最優(yōu)模型，并用驗(yàn)證集對模型進(jìn)行驗(yàn)證，旨在提高模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力，為快速、無損檢測原料奶中蛋白質(zhì)含量的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶樣品 均取自西安綜合開發(fā)總公司畜牧開發(fā)公司奶牛場，所有牛乳樣品用離心管采集，約為15mL，共270份，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

MilkoScan FT120型多功能乳制品分析儀、Infraxact型多功能近紅外光譜分析儀 均購自瑞典FOSS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光譜采集 樣品利用多功能近紅外光譜儀對樣品進(jìn)行光譜掃描。配制硅（570～1100nm）和銦鎵砷（1100～1850nm）做為檢測器，工作溫度0～40℃，測定譜區(qū)范圍570～1850nm，采樣間隔為2nm，每個樣本重復(fù)掃描3次，取平均值。保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度為20～25℃、濕度為40%～60%。采用儀器配套的化學(xué)計(jì)量軟件WinISI III來進(jìn)行定標(biāo)和模型的驗(yàn)證。

1.2.2 乳樣中蛋白質(zhì)的實(shí)際測定 利用多功能乳制品分析儀測定乳樣中乳蛋白的實(shí)際含量。

1.2.3 異常樣本剔除及樣本集的劃分 采用馬氏距離（GH=3）方法處理[12]，將馬氏距離大于3.0的樣品被認(rèn)定為異常樣品，被剔除。剩余樣本基本采用了“隔四選一”或“隔六選一”法分為定標(biāo)集和驗(yàn)證集。

1.2.4 定標(biāo)模型建立

1.2.4.1 光譜預(yù)處理方式及定量校正方法 本實(shí)驗(yàn)在建立模型之前對原始光譜進(jìn)行了預(yù)處理[13]，減少了樣品的狀態(tài)、光的散射、雜散光及儀器的響應(yīng)等因素的影響。主要采用的光譜預(yù)處理方式為：散射校正（None：無散射處理，SNV+D：標(biāo)準(zhǔn)正常化+趨勢變化法散射處理，MSC：多元散射校正）、導(dǎo)數(shù)處理（0階導(dǎo)、1階導(dǎo)、2階導(dǎo)）、平滑處理和二次平滑處理。采用的定量校正方法為：主成分回歸法（principle component regression，PCR）、偏最小二乘法（partial least square， PLS）、改進(jìn)偏最小二乘法（modified partial least square，MPLS）。

1.2.4.2 定標(biāo)模型優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)的思路，將不同的處理或參數(shù)設(shè)置設(shè)計(jì)成正交實(shí)驗(yàn)[14]。將6種不同的處理設(shè)定為6個因素，每個因素取3個水平，選取L27（313）正交表中第1、2、4、8、11、13列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table.1 Factor and levels of orthogonal test

1.2.4.3 模型優(yōu)劣評價方法 本研究采用李君霞等[14]提供的目標(biāo)函數(shù)法進(jìn)行模型的優(yōu)劣評價。目標(biāo)函數(shù)法是模型的兩個重要參數(shù)的函數(shù)（定標(biāo)決定系數(shù)和交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差），以目標(biāo)函數(shù)值f（x）=R/（1+SECV）[13]來評估模型的預(yù)測性能。

1.2.5 模型的驗(yàn)證 模型建好后，本實(shí)驗(yàn)用驗(yàn)證集來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ秃脡?，分別用不同胎次奶牛牛奶樣品中未參與定標(biāo)的驗(yàn)證樣本對建好的最優(yōu)模型進(jìn)行檢驗(yàn)。并通過相關(guān)指標(biāo)如偏差（Bias）、標(biāo)準(zhǔn)差、相關(guān)系數(shù)等來評價模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外光譜采集結(jié)果

不同胎次乳樣的光譜采集結(jié)果見圖1，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正?；?趨勢變化法散射處理、二階導(dǎo)數(shù)處理、平滑和二次平滑處理后的光譜采集結(jié)果見圖2。

2.2 樣品集的劃分結(jié)果

圖1 原料奶的近紅外光譜圖Fig.1 Near infrared spectrograms of raw milk samples

總樣品為270個，共剔除了異常樣本38個，剩余232個。其中：一胎奶牛乳樣145個，剔除異常樣本26個；二胎奶牛乳樣53個，剔除異常樣本4個；三胎及三胎以上奶牛乳樣72個，剔除異常樣本8個。樣品集經(jīng)剔除異常樣本后，結(jié)果如表2所示，可見四種不同分組中驗(yàn)證集的最大值和最小值均在定標(biāo)集的空間范圍內(nèi)，說明定標(biāo)集和驗(yàn)證集分布較為合理，均勻，具有很好的代表性。符合建立近紅外光譜分析模型的要求[15-16]。

圖2 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正?；?趨勢變化法散射處理、二階導(dǎo)數(shù)處理、平滑和二次平滑處理后的光譜圖Fig.2 Near infrared spectrograms of raw milk samples by the processing of standard normalization and trends method scattering，the second derivative processing，smoothing and secondary smoothing

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，見表3。一胎和二胎奶牛牛奶樣品的最佳因素組合均為A3B2C2D3E2F3，即定標(biāo)校正方法為MPLS，散射校正為SNV+D，導(dǎo)數(shù)處理為1階，導(dǎo)數(shù)處理間隔點(diǎn)數(shù)為8，平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為4，二次平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為8。三胎及三胎以上奶牛樣品的最佳因素組合為A2B2C3D3E3F1，即定標(biāo)校正方法為PLS，散射校正為SNV+D，導(dǎo)數(shù)處理為2階，導(dǎo)數(shù)處理間隔點(diǎn)數(shù)為8，平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為8，二次平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為1。所有胎次奶牛樣品的最佳因素組合為A2B2C2D1E2F3，即定標(biāo)校正方法為PLS，散射校正為SNV+D，導(dǎo)數(shù)處理為1階，導(dǎo)數(shù)處理間隔點(diǎn)數(shù)為1，平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為4，二次平滑處理間隔點(diǎn)數(shù)為8。

表2 樣品分集結(jié)果Table.2 Diversity results of samples

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.3 Results of orthogonal test

在各因素中，定標(biāo)校正方法和散射處理方式對模型優(yōu)劣的影響較為突出。

續(xù)表

2.4 最優(yōu)模型評價指標(biāo)的確定

對于正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，要有定量的指標(biāo)來評價模型的優(yōu)劣，在WinISI III軟件得到的定標(biāo)結(jié)果中，有以下相關(guān)指標(biāo)：相關(guān)系數(shù)（calibration coefficient of correlations，R2）用于考察預(yù)測值與實(shí)際值之間的相關(guān)程度；定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差（standard error of calibration，SEC）、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差（standard error of cross-validation，SECV）用于評價所建模型對內(nèi)部樣本的預(yù)測能力。從表4中結(jié)果可以看出，不同胎次奶牛牛奶樣品中參與定標(biāo)的樣品的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和近紅外預(yù)測數(shù)據(jù)之間的SEC值均比較低，分別為0.0531、0.0810、0.0461和0.0687。近紅外預(yù)測數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)間的R2值很高，分別為0.9626、0.9377、0.9406和0.9351。定標(biāo)建模過程中，進(jìn)行交叉驗(yàn)證計(jì)算時所獲得的近紅外預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)測定值的SECV也很低，分別為0.0641、0.1116、0.0584、0.0803。定標(biāo)建模過程中，進(jìn)行交叉驗(yàn)證計(jì)算時所得的相關(guān)系數(shù)，即模型對樣品及濃度變化所能描述出的百分?jǐn)?shù)（1-VR）較高，可達(dá)0.9455、 0.8839、0.9067、0.9119，同時目標(biāo)函數(shù)F最低值為87.5%，F(xiàn)值越高，模型的預(yù)測性能越好。

表4 最優(yōu)模型評價指標(biāo)參數(shù)Table.4 The result of evaluation index parameters of optimal models

2.5 模型的驗(yàn)證結(jié)果

用驗(yàn)證集對建好的模型進(jìn)行驗(yàn)證來評價模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力，結(jié)果見表5。其評價指標(biāo)有預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（standard error of performance，SEP）用于評價模型對外部樣本的預(yù)測能力、相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）、相對分析誤差（relative prediction deviation，RPD）。本實(shí)驗(yàn)用RSD和RPD來驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。一般情況下，當(dāng)RSD＜10%，模型可用于實(shí)際的檢測；當(dāng)RPD＞3，則模型具有良好的穩(wěn)定性和較高的預(yù)測能力[17-19]。

表5 最優(yōu)模型驗(yàn)證結(jié)果Table.5 Validation results of optimal models

由表5可看出，所有胎次奶牛乳中乳蛋白的R2值均達(dá)到87%以上，說明實(shí)際測定值和光譜預(yù)測值之間具有良好的線性關(guān)系。同時SEP值比較小，說明模型預(yù)測的準(zhǔn)確性比較高，且所有胎次的RSD＜10%，RPD＞3，說明建好的模型性能良好，預(yù)測精度高。預(yù)測結(jié)果和實(shí)際測定值很接近，因此，本研究通過近紅外光譜分析技術(shù)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合建立的模型適于所有原料奶中蛋白質(zhì)含量的測定。

所有胎次奶牛的乳中乳蛋白含量用多功能乳制品分析儀測出的真實(shí)值和近紅外光譜法預(yù)測值的線性相關(guān)圖分別如圖所示（圖3～圖6）。

圖3 一胎奶牛牛乳中乳蛋白含量實(shí)際測定值與近紅外預(yù)測值線性相關(guān)圖Fig.3 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the first parities cows

圖4 二胎奶牛牛乳中乳蛋白含量實(shí)際測定值與近紅外預(yù)測值線性相關(guān)圖Fig.4 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the second parities cows

圖5 三胎及三胎以上奶牛牛乳中乳蛋白含量實(shí)際測定值與近紅外預(yù)測值線性相關(guān)圖Fig.5 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in the third and more times parities cows

圖6 所有胎次奶牛牛乳中乳蛋白含量實(shí)際測定值與近紅外預(yù)測值線性相關(guān)圖Fig.6 Linear correlation between actual measurements value and NIR predicted value with the milk protein content in all cows

3 結(jié)論與討論

近紅外光譜分析作為一種有效的分析手段，在乳成分定量分析和質(zhì)量監(jiān)測方面得到了廣泛應(yīng)用，李慶波等[20]研究了采用近紅外光譜技術(shù)檢測牛奶中主要成分含量的方法。討論采用偏最小二乘法建立校正模型過程中數(shù)字濾波預(yù)處理方法以及利用遺傳算法優(yōu)選波段。王云等[21]研究了近紅外光譜法在牛奶主要成分分析中的應(yīng)用，重點(diǎn)對比不同近紅外區(qū)域的檢測結(jié)果。利用偏最小二乘法建立校正模型，探討了不同光譜區(qū)域和數(shù)據(jù)預(yù)處理對模型準(zhǔn)確性的影響。鄭麗敏等[22]采用傅里葉變換近紅外光譜法，快速測定了新疆疆岳驢奶中脂肪、蛋白質(zhì)、能量和灰分的含量。韓東海等[23]利用紅外光譜技術(shù)無損、快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)了純牛奶中還原奶的鑒別和原料奶新鮮度的判別。不同胎次的奶牛的乳蛋白含量不同，而本實(shí)驗(yàn)是對不同胎次奶牛乳中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行直接研究，并分別建立了最優(yōu)模型，為快速測定不同胎次奶牛的蛋白質(zhì)含量提供了方法。原料奶出售的價格在很大程度上取決于奶中乳蛋白含量的高低，因此，本實(shí)驗(yàn)的研究對于原料奶按質(zhì)論價具有重要的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜技術(shù)研究了不同胎次奶牛所產(chǎn)的牛乳中的蛋白質(zhì)的含量，結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了基于不同的光譜預(yù)處理方式和定標(biāo)校正方法建立的不同的定量分析模型，并通過目標(biāo)函數(shù)值評定出了最優(yōu)模型，然后通過未參與定標(biāo)的驗(yàn)證集樣本對最優(yōu)模型的性能進(jìn)行驗(yàn)證。采用R2、SEC、SEP三個參數(shù)來評價模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。最終建立了一胎、二胎、三胎及以上和所有胎次奶牛乳樣的模型，它們的預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)程度較高，而且模型的預(yù)測準(zhǔn)確性較高。因此，本研究所建模型性能良好，可以用于實(shí)際預(yù)測。

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Quantitative analysis of milk protein content in different parities cows based on near infrared spectroscopy

LI Shuang-hong，LIU Yong-feng*，HAN Yu-rui，ZHAO Lu-hua，YUAN Shuang
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

In this experiment，spectrum of different parities milk samples were scanned using near-infrared spectrometer（NIRS），and the protein content in milk samples was measured using the multifunctional analyzer of dairy.The models were established through orthogonal design and validated with principle component regression（PCR），partial least square（PLS），modified PLS and a variety of pretreatment methods.Then，the models were evaluated by the objective function method.The result showed that the first parity samples share the same optimal model with the second parity samples in the milk protein And their calibration coefficient of correlations（R2），standard error of calibration（SEC）and standard error of prediction（SEP）were 0.9626，0.0531，0.0630 and 0.9377，0.0810，0.1100，respectively.The optimal model of the milk protein of the third parity samples and more times samples were established，and the R2，SEC and SEP of the optimal model were 0.9406，0.0461，0.0500.Meanwhile，the optimal model of all milk protein samples were also established，and the R2，SEC and SEP of the optimal model were 0.9351，0.0687，0.0790.Therefore，it was suitable for using these models to detect simulately the milk protein rapidly，accurately and non-destructively.The analysis method provided the theoretical basis for detecting the milk protein quickly in mixed raw milk.

milk protein；near infrared spectroscopy；quantitative analysis；parity

TS252.1

A

1002-0306（2014）04-0060-06

2013－07－30 *通訊聯(lián)系人

李雙紅（1992-），女，大學(xué)本科，主要從事食品科學(xué)與安全方面的研究。

西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（NC1208-2）；陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012NY2-17）；國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃課題（201210781126）。