（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097）

大白菜雄性不育源主要有細(xì)胞核雄性不育和細(xì)胞質(zhì)雄性不育。細(xì)胞核雄性不育是張書芳等（1990）在大白菜品種萬泉青幫采種田中發(fā)現(xiàn)的；細(xì)胞質(zhì)雄性不育則由原生質(zhì)體融合、雜交和多代回交等途徑，轉(zhuǎn)育蘿卜Ogu CMS、甘藍(lán)型油菜Pol CMS 和新型甘藍(lán)型油菜CMS96 而獲得的大白菜Ogu CMS（Williams，1981；Health et al.，1994）、Pol CMS（柯桂蘭 等，1992）和CMS96（張德雙 等，2002）細(xì)胞質(zhì)雄性不育系?？梢姡蟀撞思?xì)胞質(zhì)雄性不育系的主要來源是轉(zhuǎn)育已有的十字花科細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，目前還未見直接利用蕓薹屬種間雜交的方法創(chuàng)制新型大白菜雄性不育系的報(bào)道。

為了拓寬大白菜雄性不育系資源、類型以及研究雄性不育發(fā)生的機(jī)制，本試驗(yàn)以蕓薹屬種間雜交的方法創(chuàng)制和獲得新型大白菜雄性不育系，為今后在大白菜育種中更廣范地應(yīng)用雄性不育系奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蕓薹屬異源六倍體（AABBCC，n=27）擁有蕓薹A、黑芥B、甘藍(lán)C 的全部染色體，主要性狀表現(xiàn)為：株型高大，心葉略帶紫色，葉片綠色、有缺刻、覆蠟粉，莖部粗大、略帶紫色、覆蠟粉，腋芽萌發(fā)能力強(qiáng)，花瓣黃色，花藥和柱頭正常，結(jié)實(shí)性好，種莢細(xì)長，種子較大、黑褐色（張德雙 等，2009），該異源六倍體來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心大白菜課題組；北京新3號(hào)的父本832172 也來源于本中心大白菜課題；大白菜品種金春購自遼寧東亞國際種苗有限公司，義和5號(hào)購自青島膠州市膠白蔬菜育種中心。

1.2 方法

1.2.1 雜交方法 植株盛花期時(shí)，在父本花序上預(yù)先套硫酸紙袋，選取母本生長旺盛、花蕾多的主枝做雜交，徹底摘除用于雜交的全部花蕾的6個(gè)雄蕊，然后涂抹父本的花粉到母本柱頭上，套上硫酸紙袋，并用曲別針扎口，以防止被昆蟲攜帶的花粉污染；第2 天上午再涂抹父本的花粉到母本柱頭上，然后扎好袋口。雜交完成后應(yīng)注意澆水，及時(shí)修剪多余枝條，撤掉硫酸紙袋。在母本上收獲的種子即為雜交一代。

1.2.2 試驗(yàn)步驟 試驗(yàn)在本中心日光溫室內(nèi)完成。首先，以蕓薹屬異源六倍體為母本，以大白菜品種金春為父本進(jìn)行雜交，獲得F1（AABBCC×AA）；以大白菜品種義和5號(hào)為母本，以F1（AABBCC×AA）為父本再次進(jìn)行雜交。在多親本雜交后代中即可篩選到大白菜雄性不育系MS200712（圖1）。

圖1 獲得大白菜雄性不育系MS200712 的技術(shù)路線

最后，用義和5號(hào)、北京新3號(hào)的父本832172 與大白菜雄性不育系MS200712 進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，并鑒定轉(zhuǎn)育后代的花粉育性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交一代F1（AABBCC×AA）的獲得

在金春的花序上預(yù)先套上硫酸紙袋，徹底摘除蕓薹屬異源六倍體花序中用于雜交的全部花蕾的6個(gè)雄蕊，然后涂抹金春的花粉，套上硫酸紙袋，并扎好袋口；第2 天上午再重復(fù)授粉1次。在蕓薹屬異源六倍體上收獲的種子即為F1（AABBCC× AA）。

在人工授粉獲得F1（AABBCC×AA）的過程中，為了防止因雄蕊去除不徹底而混雜自交種子，在剝蕾時(shí)只注重質(zhì)量，不追求數(shù)量，AABBCC 異源六倍體的花藥被徹底去除。采用2種保障措施：①用鑷子剝蕾時(shí)，舍棄掉那些不容易操作的小花蕾，每一個(gè)花序的授粉花蕾數(shù)不要過多，以5～10個(gè)為宜；②在第2 天重復(fù)授粉時(shí)，再次確認(rèn)是否殘留母本的花藥。由圖2可見，F(xiàn)1葉片具有葉翼、長倒卵形，抽薹、現(xiàn)蕾期較晚；而AABBCC 異源六倍體葉片沒有葉翼、近圓形，抽薹、現(xiàn)蕾期較早（張德雙 等，2009）?？梢?，F(xiàn)1與母本的性狀已經(jīng)存在較明顯差異，特別是F1葉片具有葉翼，標(biāo)志著F1基因組中存在父本金春AA基因組。SRAP 標(biāo)記的電泳檢測結(jié)果進(jìn)一步證明F1為真正的雜交種（待 發(fā)表）。

圖2 F1（AABBCC×AA）的植株

2.2 大白菜雄性不育系MS200712 的獲得和鑒定

在F1（AABBCC×AA）花序上預(yù)先套上硫酸紙袋，徹底摘除義和5號(hào)花序中用于雜交的全部花蕾的6個(gè)雄蕊，然后涂抹F1（AABBCC×AA）的花粉，套上硫酸紙袋，并扎好袋口；第2 天上午再重復(fù)授粉1次。在義和5號(hào)上收獲的種子即包含大白菜雄性不育系MS200712。

翌年春季繼續(xù)播種MS200712。在盛花期觀察MS200712 的花藥，結(jié)果花藥完全退化、敗育徹底，表現(xiàn)為雄性不育，即獲得了人工創(chuàng)造的大白菜雄性不育系MS200712。該雄性不育系葉片深綠色、長橢圓形，葉緣多鋸齒，花瓣黃色，花藥淺黃色、退化、敗育徹底，花藥長短正常，柱頭正常，蜜腺發(fā)達(dá)，可正常吸引昆蟲授粉（圖3～5）。

圖3 大白菜雄性不育系MS200712 的植株和花序

圖4 大白菜雄性不育系MS200712 的花器官

圖5 大白菜雄性不育系MS200712 的花藥和蜜腺

2.3 大白菜雄性不育系MS20071208-840 和MS20071208-916 的獲得

以MS200712 雄性不育系為母本，分別與義和5號(hào)、832172 進(jìn)行雜交，在MS200712 不育系上 收獲的種子即為MS20071208-840和MS20071208-916。分別播種MS20071208-840和MS20071208-916，在盛花期觀察花藥的育性，結(jié)果大白菜雄性不育系MS200712 不僅可以與大白菜品種正常雜交、結(jié)實(shí)，而且MS20071208-840和MS20071208-916的花藥依然表現(xiàn)為穩(wěn)定的雄性不育性。但MS200712所屬的不育類型有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 結(jié)論與討論

目前，在大白菜育種中3種主要的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Ogu CMS、Pol CMS 和CMS96 應(yīng)用較多。但改良的Ogu CMS 不育系存在回交轉(zhuǎn)育多代后植株生長勢嚴(yán)重退化、雜交優(yōu)勢差等缺點(diǎn)；Pol CMS 不育系由于溫度敏感存在育性受環(huán)境條件影響容易出現(xiàn)有粉株等缺點(diǎn)（張德雙，2006）；CMS96 不育系雖然克服了上述缺點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中存在個(gè)別組合制種產(chǎn)量偏低的問題。因此，在大白菜育種中新型不育系的不斷推陳出新顯得尤為重要，不僅有利于提高雜交種的純度，保護(hù)育種者的利益，而且提供了深入開展雄性不育系機(jī)理探究的平臺(tái)。2004年10月筆者引入蕓薹屬異源六倍體材料，初衷是以蕓薹屬異源六倍體為橋梁，將紫色甘藍(lán)的紫色性狀轉(zhuǎn)到大白菜品種中，以期獲得類似于紫色甘藍(lán)葉片的紫色大白菜資源。首先，采用蕓薹屬異源六倍體與紫色甘藍(lán)進(jìn)行正反交，試圖導(dǎo)入甘藍(lán)的紫色基因，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，雖然每年的授粉工作量很大，但很難獲得真正的雜交種；然后，用蕓薹屬異源六倍體與大白菜雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者可以正常雜交；于是，選用蕓薹屬異源六倍體與大白菜雜交，以期拓寬大白菜育種資源特別是雄性不育資源。

3.1 種間雜交拓寬了大白菜雄性不育系類型

在以往的研究中，有很多經(jīng)由屬間或種間雜交途徑獲得雄性不育尤其是新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的成功范本可供借鑒。Shiga 和Baba（1971，1973）在甘藍(lán)型油菜千莢油菜（Chisayanatane）×北陸23（Hokuriku 23）的F1中發(fā)現(xiàn)S-CMS 細(xì)胞質(zhì)雄性不育（屬于Nap CMS）。Thompson（1972）在冬春甘藍(lán)型油菜RD58×Bronowski 的F2中發(fā)現(xiàn)T-CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育（屬于Nap CMS），反交則花粉正常。李殿榮（1984）在甘藍(lán)型油菜S74-3（陜西）×〔豐收4號(hào)（四川）×7207（西藏）〕多親本雜交后代中發(fā)現(xiàn)雄性不育株，并育成1763A和6223A 雄性不育系。本試驗(yàn)中先配制遠(yuǎn)緣雜種（AABBCC×AA），再用普通大白菜品種義和5號(hào)作母本、（AABBCC×AA）作父本進(jìn)行雜交，結(jié)果在義和5號(hào)×（蕓薹屬異源六倍體×金春）多親本雜交后代中首次發(fā)現(xiàn)雄性不育材料MS200712，這是本試驗(yàn)的最大收獲。之所以選用春種大白菜金春和秋種大白菜義和5號(hào)作親本，是因?yàn)樵谶M(jìn)行雜交授粉時(shí)金春、義和5號(hào)與蕓薹屬異源六倍體的花期正好相遇。

3.2 大白菜雄性不育系MS200712 的敗育原因

以雄性不育系MS200712 為母本，分別與義和5號(hào)、北京新3號(hào)的父本832172 進(jìn)行雜交，結(jié)果表明大白菜雄性不育系MS200712可以與大白菜品種正常雜交，并獲得回交二代MS20071208-840和回交一代MS20071208-916，但結(jié)實(shí)較少。經(jīng)花期鑒定，播種的3株MS20071208-840和5株MS20071208-916全部表現(xiàn)為花藥敗育。

雄性不育系MS200712 為多親本雜交后代，細(xì)胞質(zhì)來源于義和5號(hào)，導(dǎo)致雄性不育產(chǎn)生的可能原因：①蕓薹屬異源六倍體AABBCC 的細(xì)胞核基因與義和5號(hào)的細(xì)胞質(zhì)基因互作結(jié)果；②金春的細(xì)胞核基因與義和5號(hào)的細(xì)胞質(zhì)基因互作結(jié)果。但由于本試驗(yàn)僅用義和5號(hào)獲得回交二代，鑒定的植株又少，目前很難判斷雄性不育產(chǎn)生的原因。今后的工作重點(diǎn)：①繼續(xù)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，增加回交代數(shù)，并跟蹤回交后代的育性；②著手配制（AABBCC×金春）×義和5號(hào)、金春×（AABBCC×義和5號(hào)）、（AABBCC× 義 和5號(hào)）× 金春、義和5號(hào)× 金春的多親本雜交后代，通過調(diào)查各后代單株育性，進(jìn)一步解釋MS200712 雄性不育系產(chǎn)生的可能原因；③通過分子標(biāo)記手段，開發(fā)鑒別雄性不育系的線粒體mtDNA（張揚(yáng)勇 等，2011）、葉綠體cpDNA（張揚(yáng)勇 等，2011；Wang et al.，2012）及核DNA 的SSR 等標(biāo)記，進(jìn)一步鑒定MS200712 雄性不育系類型。

本試驗(yàn)中，大白菜雄性不育系MS200712 的獲取方法具有操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育性穩(wěn)定、敗育徹底，且與其他大白菜品種雜交性良好、轉(zhuǎn)育容易。因此，可以繼續(xù)用于大白菜育種中的回交轉(zhuǎn)育，以獲得更多骨干雄性不育系材料。

今后，將開展有關(guān)大白菜雄性不育系MS200712 敗育機(jī)理的研究，包括細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面研究，力爭闡明大白菜雄性不育系MS200712 的所屬類型及其敗育機(jī)理，為該雄性不育系更好地在大白菜育種中應(yīng)用及通過種間或?qū)匍g雜交途徑創(chuàng)造更多種類的雄性不育系奠定基礎(chǔ)。

柯桂蘭，趙稚雅，宋胭脂，張魯剛，趙利民.1992.大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7的選育與應(yīng)用.園藝學(xué)報(bào)，19（4）：333-340.

李殿榮.1984.甘藍(lán)型油菜雄性不育系1763A 和6223A 的研究應(yīng)用.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：7-10.

張德雙，徐家炳，曹鳴慶，張鳳蘭.2002.大白菜轉(zhuǎn)育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的研究.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，17（1）：60-63.

張德雙.2006.大白菜CMS96 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子特性及育種應(yīng)用研究〔博士論文〕.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.

張德雙，張鳳蘭，余陽俊，趙岫云，于拴倉，徐家炳.2009.蕓薹屬異源六倍體的葉片突變體的獲得.中國蔬菜，（4）：12-16.

張書芳，宋兆仲，趙雪云.1990.大白菜細(xì)胞核基因互作雄性不育系選育及應(yīng)用模式.園藝學(xué)報(bào)，17（2）：117-125.

張揚(yáng)勇，方智遠(yuǎn)，王慶彪，劉玉梅，楊麗梅，莊木，孫培田.2011.兩種甘藍(lán)Ogura 細(xì)胞質(zhì)雄性不育源的分子鑒別.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（14）：2959-2965.

Health D W，Earle E D，Dickson M H.1994.Introgressing coldtolerant Ogura cytoplasm from rapeseed into Pak Choi and Chinese cabbage.HortScience，29：202-203.

Shiga T，Baba S.1971.Cytoplasmic male sterility in rape plants （Brassica napusL.）.Japan J Breed，21：15-17.

Shiga T，Baba S.1973.Cytoplasmic male sterility in oilseed rape （Brassica napusL.）and its utilization to breeding.Japan J Breed，23：187-197.

Thompson K F.1972.Cytoplasmic male sterility in oil-seed rape plants.Heredity，29：253-257.

Wang Q B，Zhang Y Y，F(xiàn)ang Z Y，Liu Y M，Yang L M，Zhuang M.2012.Chloroplast and mitochondrial SSR help to distinguish allocytoplasmic male sterile types in cabbage（BrassicaoleraceaL.var.capitata）.Mol Breeding，30：709-716.

Williams P H.1981.The origin and development of cytoplasmic male sterile Chinese cabbage.Taiwan：Asian Vegetable Research and Development Center：293-300.