靳曉明，尤玲玲，馮 超，葛懷娜，劉金福，*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384；2.天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津300384；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

近年來，糖尿病嚴重威脅著人類的健康，據(jù)估計，世界上大約3.4億人口正在不同程度的遭受糖尿病的困擾，而且預(yù)計到2030年這個數(shù)據(jù)將翻近一倍。最新統(tǒng)計，我國糖尿病患者已高達1.1億人，防治糖尿病已刻不容緩。對于糖尿病患者，尤其是Ⅱ型病人，餐后高血糖是發(fā)展為糖尿病的先期預(yù)兆，持續(xù)性餐后高血糖甚至可引起血管損害、功能和代謝障礙，產(chǎn)生多種并發(fā)癥[1]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑作為新型的口服降血糖藥物，廣泛的應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療，可有效降低餐后高血糖。目前，市場上的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，如阿卡波糖等合成產(chǎn)品，雖療效好，但價格較高且有副作用。因此，植物中高效低毒價廉的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑就備受人們青睞。研究發(fā)現(xiàn)苦瓜中分離得到的皂苷粗提物對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用[2-4]，可為人們提供一種天然的、安全有效的酶抑制劑類降糖活性物質(zhì)。

常見的苦瓜提取物制備的保健食品，一般是以片劑、膠囊、沖劑等形式供人們食用，活性物質(zhì)在胃腸中短時間內(nèi)集中地被消化、分解、代謝，功效作用的時間較短。本文采用銳孔凝固浴法，以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，對苦瓜皂苷提取物進行包埋，制成微膠囊，并使其具有緩釋效果，以期保護活性成分，延長在胃腸中作用時間和對分解碳水化合物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性進行更有效的抑制，同時，緩解酶抑制劑帶來的副作用，用于保健食品開發(fā)，更好的發(fā)揮其降低餐后血糖的功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜 購于天津市王頂?shù)碳t旗農(nóng)貿(mào)市場；對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG） 上海嘉適科學儀器有限公司；阿卡波糖片（拜糖平） 北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司；α-葡萄糖苷酶 上海滬峰生物科技有限公司；α-淀粉酶 北京索萊寶科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS） 天津市光復(fù)精細化工研究所；殼聚糖 威海紫光科技園有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FD-1C型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-50型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；752型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；METTLER TOLEDO型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TY-80R型搖床 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷磁儀器廠新涇分廠；TQZ-312型臺式全溫振蕩器 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LGR20-W型離心機 北京京立離心機有限公司；Bio-Tek ELX800型全自動酶標儀 美國寶特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜皂苷提取物制備 將新鮮苦瓜洗凈去瓤、切片烘干、粉碎過80目篩。稱取100g苦瓜果實干粉，加60%的乙醇1500m L，在70℃反復(fù)提取三次，每次2h。提取液過濾后濃縮至無醇味，得苦瓜皂苷粗提液，將粗提液真空冷凍干燥成粉狀備用[5]，測定其中皂苷含量[6]。

1.2.2 微膠囊的制作 稱取適量苦瓜皂苷提取物干粉和一定量的海藻酸鈉溶于50m L蒸餾水中，攪拌均勻，45℃水浴中加熱；以100m L的1%的乙酸溶液溶解一定量的殼聚糖和氯化鈣，充分攪拌，NaOH調(diào)節(jié)pH至5.5。用5m L的注射器吸取苦瓜提取物干粉海藻酸鈉溶液，緩慢滴入在搖床上振蕩的殼聚糖-氯化鈣溶液中，靜置15m in，流水洗去微球表面的苦瓜粗提物干粉，收集微球，60℃干燥12h，得直徑小于1mm的微膠囊。

1.2.3 微膠囊載藥量和包埋率測定 精確稱取微膠囊0.2g，研細，充分溶于3m L甲醇中，4000r/m in離心5min，取上清液，于468nm的波長下測定總皂苷含量。按下式計算載藥（總皂苷）量和包埋（總皂苷）率。

式中：C為所測樣品中固形物的質(zhì)量濃度；W為微球質(zhì)量；G為0.2g微球中原始添加芯材質(zhì)量；DL為微球載藥量的質(zhì)量分數(shù)；ER為微球包埋率[7]。

1.2.4 體外釋放實驗 將2g已干燥的微膠囊樣品加入100m L模擬胃液（pH1.2的鹽酸溶液）中，37℃恒溫振蕩2h，然后將樣品轉(zhuǎn)入100m L的模擬腸液（pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液）中作用10h。并在指定時間1、2、4、6、8、10、12h分別取1m L的樣液，同時補充等量的等溫介質(zhì)。所取樣液4000r/min離心5min，取上清液測定其中皂苷含量，用相同質(zhì)量的空白微膠囊作對照，方法同上。由下式求得各時間點的苦瓜提取物皂苷的累積釋放率Q。

式中：Cn為第n個時間點所取樣品中固形物的質(zhì)量濃度；V為釋放介質(zhì)總體積；Vi為第i個時間點的取樣體積；Ci為第i個時間點所取樣品質(zhì)量濃度；W為微球總質(zhì)量；DL為微球載藥量的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.5 模擬胃腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響對α-葡萄糖苷酶抑制的測定在Jutta Eichler等[8]的基礎(chǔ)上稍做修改，采用九十六孔板法，用微量移液器向每孔中準確加入樣液50μL，pH 6.8緩沖液50μL，0.2U/m L α-葡萄糖苷酶液50μL，室溫孵育20m in后，加入50μL 1.5mg/m L對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG），37℃孵育30m in，2500r/m in離心3m in，取100μL上清液，405nm測定吸光度值。蒸餾水替代樣液和緩沖液替代酶液作為空白組，蒸餾水替代樣液作為控制組。樣液為將2g已干燥的微膠囊，0.75g苦瓜提取物干粉及藥物拜糖平，分別加入100m L模擬胃液中，37℃，50r/min，恒溫振蕩2.5h，在0、0.5、1、1.5、2、2.5h分別取1m L的樣液，同時補充等量的等溫介質(zhì)。所取樣液4000r/m in離心5m in，取上清液作為樣液測定對α-葡萄糖苷酶的抑制，由于苦瓜皂苷本身有顏色，所以每個樣品測定背景吸收，對結(jié)果進行校正，按下式計算抑制率。微膠囊放入模擬腸液，方法同上，選取0、2、4、6、8、10h時間點取樣。

1.2.6 模擬胃腸環(huán)境對α-淀粉酶活性的影響 對α-淀粉酶抑制的測定在Zhang等[9]的基礎(chǔ)上稍做修改，取0.5m L樣液加入0.5m L 0.5mg/m Lα-淀粉酶液，25℃溫育10m in，再加入0.5m L 0.5%的淀粉溶液，準確反應(yīng)5m in后，加入1m L 3，5-二硝基水楊酸（DNS），90℃水浴10min，冷卻到室溫，蒸餾水定容至25m L，540nm測定吸光度值。蒸餾水替代樣液作為空白對照。樣液的獲得同1.2.5所述。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜皂苷提取物微膠囊的體外緩釋效果

在前期研究所得的最優(yōu)條件（海藻酸鈉濃度5%、殼聚糖濃度0.5%、氯化鈣濃度3.5%、海藻酸鈉與芯材的質(zhì)量比0.6∶1）下制備微膠囊，將其在模擬胃液和腸液中進行體外釋放實驗，以釋放時間為橫坐標，累積釋放率為縱坐標繪圖，結(jié)果見圖1。

圖1 微膠囊中苦瓜皂苷體外釋放曲線Fig.1 Release profiles ofMomordica charantia saponins microcapsule in vitro

由圖1可知，微膠囊中苦瓜皂苷在模擬胃液中1h釋放率達到31.19%，2h累積達到52.14%，說明在酸性條件下，微膠囊的壁材殼聚糖和海藻酸鈉形成的包膜，易遭到破壞，導(dǎo)致芯材釋放。當從胃液移入腸液后，苦瓜皂苷釋放緩慢，10h達到81.20%，可見，所制備的微膠囊在模擬的胃液和腸液中具有良好的緩釋性能，這一結(jié)果與參考文獻一致[10]。分析原因是由于海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊具有一定的耐酸性和腸溶性，可以對包埋物進行控制釋放[11]，其可能的機制是海藻酸鈉與氯化鈣發(fā)生反應(yīng)生成圓形海藻酸鈣骨架，同時將藥物包裹其中；另外，海藻酸鈉還可與殼聚糖的醋酸鹽形成聚離子復(fù)合物填塞骨架網(wǎng)眼，使藥物釋放受到阻礙[12]。這樣苦瓜提取物微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中緩慢溶脹并溶蝕，皂苷類等物質(zhì)通過溶解擴散及微膠囊的溶蝕而釋放。

2.2 模擬胃腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶抑制作用

實驗中按照微膠囊的包埋率計算，微膠囊中藥物全部釋放后苦瓜提取物干粉濃度約為7.1mg/m L，對照組苦瓜皂苷提取物干粉在胃腸環(huán)境中的初始濃度為7.5mg/m L。分別在模擬胃腸環(huán)境中微膠囊及對照組對α-葡萄糖苷酶活性的影響如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3可知，苦瓜皂苷提取物微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，而且隨著皂苷釋放量的增加，抑制率呈上升趨勢，在模擬胃環(huán)境中微膠囊釋放皂苷1h，抑制率為61.57%，2h可達到80%以上；在模擬腸環(huán)境中2h，抑制率為51.35%，4h達到68.92%，8h后仍然具有抑制作用，累計抑制率為80.24%。與之相反，未包埋的苦瓜皂苷提取物和拜糖平藥物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨時間推移在模擬胃腸環(huán)境中有逐漸下降的趨勢，胃中2h后抑制率分別下降了27.07%和28.34%，腸中6h后抑制率分別下降了6.77%和2.37%。從α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用機理看，它是通過與小腸粘膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結(jié)合，競爭性抑制其相對活性，使葡萄糖的吸收減緩，吸收時間后延，從而降低餐后高血糖[13-14]，其發(fā)揮作用的場所主要在腸道中。從圖2、圖3中可以得出，苦瓜皂苷提取物通過微膠囊化包埋后，對有效成分起到了一定的保護作用，最大限度的減少了苦瓜皂苷活性成分在胃液中的破壞，從而使更多的活性成分進入到腸道中發(fā)揮效力。臨床上，服用拜糖平后，大量碳水化合物在小腸內(nèi)吸收受阻，進入大腸后碳水化合物酵解增加，產(chǎn)氣增多，常會引起腸鳴，腹脹，惡心，嘔吐，食欲減退，甚至導(dǎo)致胃腸痙攣性疼痛、頑固性便秘等不良反應(yīng)。圖3顯示，隨著時間的推移，在腸環(huán)境中微膠囊由于具有緩釋效果而不斷釋放皂苷等物質(zhì)，持續(xù)的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。通過包埋可以有效的緩解大量藥物進入腸道后集中釋放可能帶來的副作用。

圖2 模擬胃環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic gastric environment

圖3 模擬腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic intestinal environment

2.3 模擬胃腸環(huán)境對α-淀粉酶抑制作用

在模擬胃腸環(huán)境中微膠囊及對照組對α-淀粉酶活性的影響如圖4、圖5所示。

由圖4、圖5可知，微膠囊對α-淀粉酶有一定的抑制作用，而且隨著在胃腸中的皂苷釋放量的增加，抑制率均有上升趨勢，且都是剛開始抑制率增長速率較快，隨著時間的推移，抑制率增長速率減慢，相反的，未包埋的苦瓜皂苷提取物和藥物拜糖平對α-淀粉酶的抑制作用隨時間推移都有所降低。在模擬胃環(huán)境中微膠囊釋放皂苷0.5h，抑制率為28.67%，2h后達到40%以上；在模擬腸環(huán)境中微膠囊釋放皂苷2h，抑制率為18.69%，8h后累計抑制率為24.52%。α-淀粉酶是通過與酶形成酶抑制劑復(fù)合物，使酶失活，從而延緩或阻礙了碳水化合物在腸道內(nèi)的消化和吸收，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂水平，從而有效的防止餐后高血糖的發(fā)生[15-16]。同樣的，從圖4、圖5我們可以看出，通過對苦瓜皂苷提取物進行包埋，隨著時間的推移，對α-淀粉酶抑制率不斷提高，起到了對功效成分的保護作用，同時可以控制釋放，延長了天然產(chǎn)物活性成分的作用時間，可減少食用次數(shù)，提高其利用率，并減少副作用。

圖4 模擬胃環(huán)境對α-淀粉酶活性影響Fig.4 Alpha amylase activity effect in mimic gastric environment

圖5 模擬腸環(huán)境對α-淀粉酶活性影響Fig.5 Alpha amylase activity effect in mimic intestinal environment

3 結(jié)論

本實驗以殼聚糖，海藻酸鈉為壁材，對苦瓜提取物進行了包埋，在前期研究得出最佳的制備工藝條件下制得的苦瓜提取物微膠囊，在模擬胃液中2h，苦瓜提取物皂苷累積釋放率為52.14%，再在腸液中釋放10h，累積釋放率達81.2%，表明微膠囊緩釋性能良好。而且微膠囊在胃腸中緩慢釋放，均顯示對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有一定的抑制作用，抑制率隨著釋放量的增加有上升趨勢，相比較未包埋的苦瓜提取物和拜糖平，微膠囊化起到了保護活性成分、延長作用時間、提高藥物利用率和緩解副作用等效果。該研究為開發(fā)具有輔助降血糖功效的功能食品提供了參考。

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