任 杰，胡志和，李金星

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134)

酪蛋白(casein，簡稱CN)，是在pH4.6、溫度為20℃的條件下，從脫脂乳中沉淀下來的一種蛋白質(zhì)［1－2］。它由乳腺上皮細(xì)胞合成，含有大量磷和鈣，是哺乳動物奶中的主要蛋白質(zhì)，約占乳蛋白的76%～86%，包括 αs1－酪蛋白、αs2－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白［3－4］。酪蛋白含有人體必需的8種氨基酸，能夠與磷和鈣結(jié)合，可以促進人體對鈣磷離子的吸收，具有調(diào)節(jié)免疫的作用［5－7］。目前，國內(nèi)外對酪蛋白的研究大多集中在具有特殊生理功能的酪蛋白水解物，即生物活性肽上，李偉等［8］和李榮華等［9］研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白糖巨肽具有調(diào)節(jié)免疫的作用，彭登峰等［10］和杜軍等［11］發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物可以抑菌，紀(jì)銀莉等［12］研究表明酪蛋白水解物具有抗氧化的作用，張艷等［13］研究發(fā)現(xiàn)α－酪蛋白的水解產(chǎn)物可以降血壓，Jolles等［14］研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物具有抗血栓作用，Noni［15］研究表明酪蛋白水解物可以調(diào)節(jié)腸胃吸收，而對于酪蛋白在胃液中消化情況的研究較少。由于牛初乳中酪蛋白含量較高，在胃中形成較大凝塊，導(dǎo)致消化困難，特別是對新生兒，易造成消化不良。

超高壓技術(shù)作為一種新型的非熱殺菌技術(shù)［16］，它的優(yōu)勢在于，高壓處理只作用于疏水鍵、氫鍵以及離子鍵等非共價鍵，對共價鍵無明顯的影響，所以它不會破壞蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，但會改變其高級結(jié)構(gòu)［17］，使組織發(fā)生變性，改善功能性質(zhì)，如增強乳制品的吸光度和濁度［18］，提高蛋白質(zhì)的可消化性。本實驗以牛初乳為原料，通過模擬胃消化液對酪蛋白進行消化處理，旨在探討不同的超高壓處理條件對乳品中酪蛋白可消化性的影響，為乳品在人體內(nèi)的消化情況的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳(產(chǎn)犢48h內(nèi)) 由天津市武清區(qū)德興隆奶業(yè)有限公司提供。

胃蛋白酶、β－酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、L－酪氨酸 美國Sigma公司;甲醇(色譜純級)、三氯乙酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;鹽酸、NaCl天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司;NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠;乳酸、乳酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;酪素 天津市東方衛(wèi)生材料廠。

HPP.L3－600/0.6超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;BECKMAN COULTER毛細(xì)管電泳儀 貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;未涂層彈性石英毛細(xì)管 河北永年銳灃色譜器件有限公司;TU－1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SMART系列超純水系統(tǒng) 上?？道追治鰞x器有限公司。

1.2 樣品的超高壓處理

將生鮮牛初乳裝于塑料袋內(nèi)，真空密封后進行超高壓處理，對照組樣品為0.1MPa下的牛初乳。

1.2.1 不同的壓力處理牛初乳 施壓溫度為30℃，保壓時間為20m in，選取100、200、300、400、500和600MPa的壓力條件處理牛初乳。

1.2.2 不同的施壓溫度處理牛初乳 處理壓力為350MPa，保壓時間為20m in，選取20、25、30、35和40℃的溫度條件處理牛初乳。

1.2.3 不同的保壓時間處理牛初乳 處理壓力為350MPa，施壓溫度為30℃，分別選取10、20、30、40、50和60min的保壓時間處理牛初乳。

1.2.4 高靜壓處理牛初乳的條件優(yōu)化 選用處理壓力、施壓溫度和保壓時間作為實驗因素，正交實驗設(shè)計見表1。

表1 高靜壓處理牛初乳正交實驗因素水平表Table1 The orthogonal factor－level design of high static pressure processing bovine colostrum

1.3 模擬胃消化液實驗

將經(jīng)過超高壓處理后的牛初乳進行模擬胃液消化實驗。

1.3.1 胃蛋白酶活力的測定 按照國標(biāo)GB/T 23527－2009紫外分光光度法測定蛋白酶活力，配制L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0、10、20、30、40和50μg/m L，紫外分光光度計(275nm)測定其吸光度值，繪制L－酪氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取試管吸取酶液2.00m L置于40℃的水浴中，2m in后加入已預(yù)熱的酪素2.00m L，搖勻后置于40℃的水浴中反應(yīng)2m in，加入4.00m L的三氯乙酸，搖勻后置于水浴鍋中，10m in后過濾，取其上清液測其吸光度值?？瞻捉M加入的酪素和三氯乙酸順序相反，其他一致。

式中:X－樣品的酶活力，(U/mg);A－試樣溶液的平均吸光度;K－吸光常數(shù);8－反應(yīng)試劑的總體積，m L;2－吸取酶液2.00m L;1/10－反應(yīng)時間10m in，以1m in計;n－稀釋倍數(shù);1/C－吸取酶液的濃度，1mg/m L;E－紫外法與福林法的換算系數(shù)(中性、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50;酸性蛋白酶系數(shù)為0.77)。

1.3.2 模擬胃消化液的配制 稱取0.2g氯化鈉(NaCl)和Amg胃蛋白酶，加入70m L重蒸餾水，加入730μL鹽酸，再用鹽酸調(diào) pH至 1.2，加水定容至100m L?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

根據(jù)公式:計算100m L模擬胃消化液中胃蛋白酶的添加量:

式中:A－胃蛋白酶添加量，單位為毫克(mg); B－胃蛋白酶活力，單位為單位活力每毫克(U/mg)。

1.3.3 樣品的可消化性處理 參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)部869號公告－2－2007“轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性實驗方法”進行實驗。在7m L離心管中加入1.9m L模擬胃消化液，37℃恒溫水浴 5min。加入100μL樣品蛋白溶液，迅速漩渦振蕩并快速置于37℃水浴，準(zhǔn)確記錄時間，在每個反應(yīng)時間點(0、2、30和60m in)，迅速吸取反應(yīng)液200μL，加入1.5m L離心管中(含有70μL 0.2mol/L碳酸氫鈉溶液)，冰浴、沸水浴各5min，取出后冷卻至室溫備用。

1.4 毛細(xì)管電泳條件

75μm×57cm i.d.未涂層彈性石英毛細(xì)管，緩沖溶液A為pH8.0磷酸鹽緩沖液，分離電壓25kV，檢測波長214nm，操作溫度25℃，以壓力0.5psi進樣，進樣時間8s［19］。新裝毛細(xì)管在使用前用甲醇(HPLC純級)、0.1mol/L鹽酸水溶液、1mol/L NaOH溶液、運行緩沖液A和重蒸水等進行預(yù)處理，每次進樣前分別用1mol/L的NaOH、超純水及分離緩沖液沖洗，以保證遷移時間和校正峰面積的重現(xiàn)性，實驗所用溶液和樣品液在使用前均用0.45μm微孔濾膜過濾［20－21］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表制作利用軟件 SPSS和Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶活力的測定

由圖1可以看出，L－酪氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.0075x－0.0056，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性很好，結(jié)果準(zhǔn)確性高，具有較高的可信度。根據(jù)回歸方程，當(dāng)吸光度值為1時酪氨酸的量為134.08μg，即吸光常數(shù)K值為134.08，在130～135范圍內(nèi)，結(jié)果可靠。

實驗測得試樣溶液的平均吸光度值為0.750，根據(jù)公式算得，樣品的酶活力為1249U/mg，模擬胃消化液中胃蛋白酶的添加量為210.8mg。

2.2 毛細(xì)管電泳圖譜

如圖2，標(biāo)準(zhǔn)品的電泳譜圖顯示，β－酪蛋白在18m in出峰。毛細(xì)管電泳分離樣品的原理是電泳遷移和電滲遷移，將樣品引入毛細(xì)管進樣一端，施加直流電壓后，各組分會形成電泳流和電滲流流向毛細(xì)管出口端，按分子量大小及其電荷大小的順序依次通過檢測器。其中 β－酪蛋白的分子量為24ku，αs1－酪蛋白的分子量為23.6ku，αs2－酪蛋白的分子量為25ku，酪蛋白各種亞類分子量接近，遷移時間相近，可以斷定圖中B、C、D在18m in出峰的物質(zhì)為酪蛋白。對比圖中B、C、D，經(jīng)過消化處理后在18m in的峰面積明顯減小，而9m in時的峰面積從無到有并逐漸增大，判斷其為酪蛋白消化物。所以選擇不同處理條件下9m in和18m in這兩個遷移時間的峰進行比較。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的毛細(xì)管電泳圖Fig.2 Capillary electrophoretogram of standard and sample

圖1 L－酪氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of L－Tyrosine solution

2.3 壓力對牛初乳中酪蛋白模擬胃液可消化性的影響

當(dāng)施壓溫度和保壓時間固定為30℃和20min，分別選取100、200、300、400、500和600MPa的壓力條件處理牛初乳，對處理后的樣品進行模擬胃液的消化實驗，再采用毛細(xì)管電泳儀對其進行檢測。

圖3中A、B分別為樣品經(jīng)模擬胃液消化后酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面積。由圖3可以看出，牛初乳經(jīng)過超高壓處理以后，在所選壓力范圍內(nèi)，模擬胃液消化時間越長，牛初乳中酪蛋白的峰面積越小，酪蛋白消化物的峰面積越大;當(dāng)模擬胃液消化時間相同時，隨著處理壓強的增大，酪蛋白的峰面積逐漸減小，酪蛋白消化物的峰面積逐漸增大;當(dāng)模擬胃液消化時間為60m in時，圖3中A圖的顯著性分析結(jié)果顯示只有處理壓強為400MPa和500MPa時的結(jié)果沒有顯著性差異，其他處理條件之間均有顯著性差異，而且從圖中也可以明顯看出，隨著處理壓強的增大，酪蛋白的峰面積在逐漸減小，與圖3中B圖隨著處理壓強的增大，酪蛋白消化物的峰面積在逐漸增大相一致，B圖中顯著性分析結(jié)果顯示各個處理條件之間有顯著性差異;當(dāng)模擬胃液消化時間為30m in時，酪蛋白的峰面積在各個處理條件下的結(jié)果均有顯著性差異，酪蛋白消化物的峰面積除處理壓強為100MPa和200MPa時結(jié)果分析無顯著性差異，其他處理條件下均有顯著性差異;當(dāng)模擬胃液消化時間為2min時，雖然在圖中看不出明顯變化，但顯著性分析結(jié)果顯示酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面積在不同處理壓強下消化效果顯著。

圖330℃保壓20min條件下不同壓力處理牛初乳其酪蛋白可消化性的變化Fig.3 Digestibility change of casein at different pressure treatment bovine coloctrum with 30℃ for 20min

2.4 溫度對牛初乳中酪蛋白模擬胃液可消化性的影響

當(dāng)處理壓強和保壓時間固定為 350MPa和20m in，分別選取20、25、30、35和40℃的溫度條件處理牛初乳，對處理后的樣品進行模擬胃液的消化實驗，再采用毛細(xì)管電泳儀對其進行檢測。

圖4中A、B分別為樣品酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面積。由圖4可以看出，當(dāng)高靜壓處理條件一致時，酪蛋白的峰面積隨著模擬胃液消化時間的增加而減小，酪蛋白消化物的峰面積變化則與之相反;當(dāng)模擬胃液的消化時間固定時，在所選的溫度范圍內(nèi)，施壓溫度越高，牛初乳中酪蛋白的峰面積越小，酪蛋白消化物的峰面積越大;當(dāng)模擬胃液消化時間為2m in時，酪蛋白的峰面積除35℃與30℃和40℃的處理結(jié)果無顯著性差異外，其他施壓溫度下的結(jié)果之間均有顯著性差異，酪蛋白消化物的峰面積在實驗所選擇的施壓溫度下均有顯著性差異;當(dāng)模擬胃液消化時間為30m in時，酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面積在不同施壓溫度下有顯著性變化;當(dāng)模擬胃液消化時間為60m in時，酪蛋白的峰面積在各施壓溫度下均有顯著性變化，雖然酪蛋白消化物的峰面積在施壓溫度為20℃和25℃下的顯著性分析沒有差異，但在其他施壓溫度下均有顯著性變化。

圖4 350MPa保壓20min條件下不同溫度處理牛初乳其酪蛋白可消化性的變化Fig.4 Digestibility change of casein at different temperature treatment bovine coloctrum with 350MPa for 20min

2.5 保壓時間對牛初乳中酪蛋白模擬胃液可消化性的影響

當(dāng)處理壓強和施壓溫度固定為350MPa和30℃，分別選取10、20、30、40、50和60min的時間條件處理牛初乳，對處理后的樣品進行模擬胃液的消化實驗，再采用毛細(xì)管電泳儀對其進行檢測。

圖5中A、B分別為樣品酪蛋白和酪蛋白消化物的峰面積。由圖5可知，當(dāng)模擬胃液消化時間一定時，在所選的保壓時間范圍內(nèi)，保壓時間越長，酪蛋白的峰面積越小，酪蛋白消化物的峰面積越大，說明保壓時間越長，酪蛋白模擬胃液的可消化性越好。當(dāng)模擬胃液的消化時間為30min時，酪蛋白的峰面積保壓時間為50min和60min時無顯著性差異，其他保壓時間條件下的處理結(jié)果均有顯著性差異(p＜0.05)，酪蛋白消化物的峰面積在各個保壓時間條件下的處理結(jié)果均有顯著性差異(p＜0.05);當(dāng)模擬胃液的消化時間為60min時，酪蛋白的峰面積在保壓時間為40m in和50m in時無顯著性差異，其他保壓時間條件下的處理結(jié)果均有顯著性差異(p＜0.05)，酪蛋白消化物的峰面積在各個保壓時間條件下的處理結(jié)果均有顯著性差異(p＜0.05)。

圖5 350MPa施壓溫度30℃條件下不同時間處理牛初乳其酪蛋白可消化性的變化Fig.5 Digestibility change of casein at different time treatment bovine coloctrum with 350MPa and 30℃

2.6 高靜壓處理對牛初乳中酪蛋白模擬胃液可消化性影響的條件優(yōu)化

表2 高靜壓處理牛初乳條件優(yōu)化Table2 The conditions optimization of high static pressure processing bovine colostrum

由表2牛初乳中酪蛋白模擬胃液消化30m in后的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析k值可知，最優(yōu)組合為A3B3C3，即處理條件為550MPa、40℃、25m in;由極差分析結(jié)果可知:RA＞RB＞RC，因此上述三個影響因素對牛初乳中酪蛋白可消化性的作用大小順序為:壓強大?。臼簻囟龋颈簳r間;依據(jù)模擬胃液消化60min后牛初乳中酪蛋白含量的相關(guān)數(shù)據(jù)，k值分析和極差分析的結(jié)果均與模擬胃液消化30min后的結(jié)果相一致。

在優(yōu)化條件下處理牛初乳，即進行最優(yōu)組合A3B3C3的驗證實驗，結(jié)果顯示，酪蛋白模擬胃液消化30m in和60m in后的峰面積分別為31027mAu和0。由表2中數(shù)據(jù)可知，在 550MPa、35℃、15min和500MPa、40℃、15m in和550MPa、40℃、20m in這三個條件下，60m in后酪蛋白已全部被消化。但相比消化時間為30m in的效果，選擇壓力為550MPa、施壓溫度40℃、保壓25m in處理牛初乳效果更好。

3 討論

超高壓處理改變了蛋白質(zhì)三級、四級結(jié)構(gòu)的非共價鍵，隨著壓力的增大，酪蛋白膠粒中的氫鍵、疏水作用力和離子鍵逐步被打斷，蛋白膠粒被壓縮，直徑減?。?2］，從而影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，使得高壓處理后的蛋白質(zhì)因結(jié)構(gòu)伸展而松散，暴露出更多的酶切位點，進而易于酶解反應(yīng)的進行，促進了酶對蛋白質(zhì)的催化特性［23－24］，提高了蛋白質(zhì)的可消化性，有利于人體對營養(yǎng)成分的吸收。

研究表明，β－乳球蛋白、卵清蛋白經(jīng)超高壓處理后，酶解能力得到了很好地改善［25－28］。Henrik Stapelfeldt等［29］研究發(fā)現(xiàn)，β－乳球蛋白會隨著處理壓力的升高，可消化性逐漸增強。Vander Plancken等［30］和Quirós等［25］報道，超高壓處理會促進卵清蛋白被胰蛋白酶所水解。鄭曉瑩等［31］以12%TCASN/TN含量的變化為指標(biāo)研究超高壓處理對Feta奶酪成熟期限的影響，發(fā)現(xiàn)超高壓處理可以加速蛋白質(zhì)的降解。趙偉等［32］采用吸光度法檢測牡蠣蛋白酶水解活力的實驗中表明，超高壓處理提高了蛋白質(zhì)水解酶的活力，而且水解程度隨著壓力的升高而增大。盧婷等［33］在加熱與超高壓對縊蟶蛋白質(zhì)變性及酶解的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，超高壓加工的縊蟶比熱加工的產(chǎn)品被酶水解的程度增大，更易于被人體消化吸收。鄭捷等［34］采用SDS－PAGE電泳檢測海鱸魚魚肉時發(fā)現(xiàn)，超高壓處理會使肌漿蛋白和肌原纖維蛋白發(fā)生變性，降解程度加劇。

4 結(jié)論

在所選擇的實驗條件范圍內(nèi)，牛初乳經(jīng)過超高壓處理以后，酪蛋白模擬胃液的可消化性得到了很好的改善作用，與上述研究超高壓處理會使得一些蛋白被酶水解的程度或者降解能力增強相一致。那是因為超高壓處理改變了酪蛋白的分子結(jié)構(gòu)，使得酪蛋白在模擬胃液的消化反應(yīng)中促進了酶對其的催化反應(yīng)進程，從而改善了酪蛋白在模擬胃液中的可消化性，而且處理壓強、施壓溫度和保壓時間均會影響酪蛋白的可消化性效果。

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