黃婷，李莉萍，王瑞，梁萬文，羅洪林，陳福艷，張彬，楊傳萍，羅永巨，陳明，甘西

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530021;2.安徽省當(dāng)涂縣水產(chǎn)局，安徽 當(dāng)涂243100)

研究海豚鏈球菌的血清型有助于有針對性地制定海豚鏈球菌病的防控措施。海豚鏈球菌不能采用傳統(tǒng)的Lancefield 鏈球菌血清型分型方法對其進(jìn)行血清型鑒定［1］，因此，至今尚未建立其血清型鑒定系統(tǒng)。以色列、美國、日本和中國分別采用血清凝集試驗(yàn)和/或RAPD 方法，研究報(bào)道了各地海豚鏈球菌流行菌株所具有的不同血清型［2-5］，然而，因無標(biāo)準(zhǔn)血清，加之所采用的分型方法不同，對目前海豚鏈球菌究竟有幾種血清型尚不清楚。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記(RAPD)技術(shù)因其具有快速可靠、靈敏度高、檢測容易、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、支原體等微生物的血清型分型研究中。Bachrach等［2］采用RAPD 技術(shù)證實(shí)，不同血清型(Ⅰ和Ⅱ型)的海豚鏈球菌具有兩種不同的RAPD 帶型(基因多態(tài)性)。

目前國內(nèi)關(guān)于海豚鏈球菌血清型的研究僅見兩例報(bào)道。周素明［5］采用微量凝集方法，以國外標(biāo)準(zhǔn)株為對照，對廣東省所分離的26 株海豚鏈球菌及浙江省所分離的1 株分離菌株進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果表明，海豚鏈球菌分為2種血清型;程爽［6］采用RAPD 技術(shù)對山東省分離到的1 株海豚鏈球菌SF1 進(jìn)行基因多態(tài)性分析，確認(rèn)其與血清型Ⅰ型海豚鏈球菌的基因多態(tài)性一致。國內(nèi)對海豚鏈球菌血清型的研究局限于廣東省、山東省和浙江省的臨床菌株，尚未對其他地區(qū)海豚鏈球菌臨床菌株的血清型進(jìn)行深入研究。本研究中，采用RAPD 技術(shù)對2006—2011年從廣西分離到的22 株海豚鏈球菌進(jìn)行基因多態(tài)性分析，以期闡明廣西海豚鏈球菌的基因多態(tài)性特征，為針對性地篩選中國羅非魚海豚鏈球菌病疫苗候選菌株及疫苗研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，細(xì)菌API 20 生化鑒定試劑條購自法國梅里埃試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本試驗(yàn)中所用菌株均為廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2006—2011年從廣西養(yǎng)殖的羅非魚Oreochromis Niloticus和卵形鯧鲹Trachinotus ovatus 中分離的海豚鏈球菌流行菌株，各菌株詳細(xì)信息如表1所示。

表1 試驗(yàn)菌株信息Tab.1 Information on the experimental bacterial strains

1.2 方法

1.2.1 二重PCR 鑒定 將細(xì)菌置于含TSB 液體的培養(yǎng)基中，28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 ～48 h 后，按細(xì)菌DNA 抽提試劑盒說明書操作，抽提23 株細(xì)菌的基因組DNA，分裝后于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。二重PCR 擴(kuò)增參照黎炯等［7］的方法進(jìn)行，無乳鏈球菌引物為

P-F:5' AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT 3'，

P-R:5' CAGTAATCAAGCCCAGCAA 3'。

海豚鏈球菌引物為

P-F:5' CTAGAGTACACATGTACTTAAG 3'，

P-R:5' GGATTTTCCACTCCCATTAC 3'。

無乳鏈球菌特異性擴(kuò)增片段大小為474 bp，海豚鏈球菌特異性擴(kuò)增片段大小為296 bp。

1.2.2 海豚鏈球菌的生化鑒定 生化鑒定步驟參照API STREP 20 試劑條使用說明書進(jìn)行。

1.2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記(RAPD)分析

以23 株細(xì)菌的基因組DNA 為模板，以5' GATCAAGTCC 3'［2］為引物，進(jìn)行RAPD PCR。PCR 體系(共50 μL):10 ×Buffer(Mg2+)5.0 μL，dNTP 4.0 μL，引物1.0 μL，DNA 模板0.5 μL，Takara Ex Taq(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR儀器為德國Biometra 公司的T GraDient。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃下預(yù)變性5 min;95 ℃下變性30 s，38℃下退火1 min，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸10 min。用15 g/L 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用GoldView Ⅰ型核酸染色劑進(jìn)行染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR 擴(kuò)增

23 株海豚鏈球菌二重PCR 檢測結(jié)果見圖1。陽性對照出現(xiàn)2 條特異性條帶，23 株海豚鏈球菌均在預(yù)期296 bp 處出現(xiàn)了目的條帶。

圖1 23 株菌株的二重PCR 擴(kuò)增圖Fig.1 Duplex PCR analysis of the 23 bacterial strains

2.2 生化鑒定分型

23 株細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)詳細(xì)結(jié)果見表2。由表2可知，GX003、GX005、GX023和GX025 的精氨酸水解(ADH)呈陰性反應(yīng)，其余均為陽性。

表2 23 株試驗(yàn)菌株的生化反應(yīng)結(jié)果Tab.2 Biochemical characterization of the 23 bacterial strains

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記結(jié)果見圖2。1 號(hào)菌株為海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29178，其在750 bp 處出現(xiàn)了特異性條帶。本實(shí)驗(yàn)室分離到的另外22 株菌株也均在750 bp 處出現(xiàn)了特異性條帶，且均出現(xiàn)3 條明顯的條帶。推測本實(shí)驗(yàn)室分離保存的23 株菌與海豚鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29178 屬于同一個(gè)血清型，均為血清型Ⅰ型海豚鏈球菌。

圖2 RAPD 分析菌株電泳圖Fig.2 RAPD analysis of the 23 bacterial strains

3 討論

近年來，中國羅非魚養(yǎng)殖深受鏈球菌病的危害，嚴(yán)重影響了羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。2009年前還可用抗生素控制病情，而近幾年抗生素的效果越來越不明顯。防治該病的有效途徑是使用疫苗，但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道疫苗在使用時(shí)免疫效果差異較大，曾經(jīng)免疫效果很好的疫苗，后來卻失去免疫保護(hù)作用［2，8］。筆者在幾年的生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，有些養(yǎng)殖場使用疫苗后幾乎不發(fā)病，而有些則是推遲發(fā)病，推測這可能與各時(shí)期、各區(qū)域病原血清型差異有關(guān)。Bachrach等［2］對海豚鏈球菌血清型與基因多態(tài)性進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)以色列1997—2000年分離到的海豚鏈球菌較之前分離菌株具有不同的基因多態(tài)性，并且2種基因多態(tài)性對應(yīng)2種血清型，即基因多態(tài)性中出現(xiàn)750 bp 條帶的菌株對應(yīng)血清型Ⅰ型海豚鏈球菌，未出現(xiàn)750 bp 條帶的菌株對應(yīng)血清型Ⅱ型海豚鏈球菌。國內(nèi)對海豚鏈球菌的研究起步較晚，柴家前等［9］最早(2002年)報(bào)道了中國羅非魚海豚鏈球菌病;周素明［5］于2010年首次報(bào)道了廣東省分離的海豚鏈球菌有2種不同的血清型，研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29178、浙江分離株SO-2、淡水菌株(廣東)與海水菌株(廣東)屬于同一類的血清型;本研究結(jié)果表明:廣西地區(qū)從2006—2011年，海豚鏈球菌的基因多態(tài)性未發(fā)生變化，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29178、淡水菌株(廣西)與海水菌株(廣西)的基因多態(tài)性相同，根據(jù)Bachrach等［2］的研究結(jié)果，可推測廣西所分離的菌株均為血清型Ⅰ型海豚鏈球菌;程爽［6］也研究發(fā)現(xiàn)，海水菌株SF1 屬于血清型Ⅰ型海豚鏈球菌。國內(nèi)外的研究結(jié)果表明，海豚鏈球菌目前至少存在2種不同血清型，這些結(jié)果為今后疫苗的研發(fā)及疫苗在國內(nèi)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

Barnes等［3］研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸水解酶為陽性的海豚鏈球菌，其RAPD 分型能擴(kuò)增出750 bp 的特異條帶;而精氨酸水解酶為陰性的海豚鏈球菌，其RAPD 分型則在750 bp 無特異性條帶。本試驗(yàn)研究結(jié)果與Barnes等［3］的研究結(jié)果不同，RAPD 反應(yīng)在750 bp 處均出現(xiàn)了特異性條帶，但是GX003、GX005、GX023和GX025 的精氨酸水解酶呈陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果與周素明［5］的研究結(jié)果也存在差異，周素明所分離的2 個(gè)血清類群的所有菌株的精氨酸水解酶反應(yīng)均呈陽性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能歸因于生理生化鑒定結(jié)果的不準(zhǔn)確性或試驗(yàn)人員個(gè)體主觀判斷誤差;也可能是筆者收集的菌株不夠多，具體原因有待進(jìn)一步研究。

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［5］周素明.魚類海豚鏈球菌流行病學(xué)及診斷技術(shù)的研究［D］.廣州:中山大學(xué)，2010.

［6］程爽.一株海豚鏈球菌的分離鑒定及其亞單位疫苗研究［D］.青島:中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)，2010.

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