謝少林，房偉平、2，陳金濤、2，王超、2，鄒記興

(1.華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州510642;2.清遠市北江水產(chǎn)科學研究所，廣東 清遠511510)

斑鳠Mystus guttatus 隸屬于鲇形目、鲿科、鳠屬，俗稱魽魚、芝麻魽、白須鰍、花魽，棲息于江河底層，以小型水生動物為食，分布于珠江、元江等水系［1-2］，其肉質(zhì)細嫩、味鮮美，是珠江“四大名魚”之一。隨著社會的發(fā)展和人類活動的不斷增加，對適合野生斑鳠繁衍的自然生態(tài)環(huán)境的破壞日益嚴重，水體污染、水域減少、過渡捕撈等，使得野生斑鳠數(shù)量不斷減少，然而市場需求卻在不斷增加，因此，對其繁殖生物學方面進行研究已迫在眉睫。目前，有關(guān)斑鳠的研究僅見國內(nèi)有報道，內(nèi)容主要涉及遺傳多樣性［3-4］、人工養(yǎng)殖與繁育技術(shù)［5-7］、疾病防治［8-9］、營養(yǎng)［10-11］等方面。但大規(guī)模的人工育苗始終未完全獲得成功，有關(guān)斑鳠生殖生理及其性腺發(fā)育方面的研究尚屬空白。本研究中，通過對人工生態(tài)馴養(yǎng)斑鳠的性腺發(fā)育進行研究，以期掌握人工馴養(yǎng)下的野生斑鳠性腺發(fā)育規(guī)律，為進行斑鳠的人工繁殖提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑鳠于2010年6—8月取自中山市水潤漁業(yè)種養(yǎng)有限公司，此批魚由該公司于2008年初從廣西桂平、廣東韶關(guān)等地引進的約4月齡魚苗養(yǎng)殖而成，試驗魚共計48 尾，其中雄性28 尾，雌性20 尾。2012年9月—2013年6月補充采集樣品，共采集斑鳠20 尾，其中雌性11 尾，雄性9 尾。

1.2 方法

對新鮮樣本魚測量體長(精確到0.1 cm)和稱量體質(zhì)量(精確到0.01 g)后，解剖取其性腺并稱重(精確到0.01 g)，計算性腺成熟系數(shù)(GSI)。性腺經(jīng)體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林固定后，按常規(guī)石蠟切片操作步驟進行制片，用Leica DM2500 顯微鏡觀察并拍照。性腺分期主要依據(jù)劉筠［12］和樓允東［13］的分期標準。性腺成熟系數(shù)計算公式［14］為

2 結(jié)果

2.1 卵母細胞發(fā)育的組織學觀察

第Ⅰ時相卵母細胞 此時相的卵母細胞多見于發(fā)育未成熟的卵巢中，處于卵原細胞階段，其不被濾泡細胞所包圍，胞質(zhì)少，體積小，細胞形狀不規(guī)則，多為橢圓形，中央或邊緣有一核仁(圖1 -A)。

第Ⅱ時相卵母細胞 卵母細胞停止分裂后，細胞核和細胞質(zhì)開始增長，進入其小生長階段［12］，細胞形狀基本呈圓形，其細胞膜外出現(xiàn)單層的濾泡細胞。胞質(zhì)嗜堿性增強，H.E 染色為藍色(圖1 -B)。

第Ⅲ時相卵母細胞 由小生長期進入大生長期，細胞體積及其核體積進一步增大，胞質(zhì)嗜堿性減弱，H.E 染色為淡紫色。細胞質(zhì)邊緣開始出現(xiàn)少量卵黃粒，濾泡膜由第Ⅱ時相的一層變?yōu)閮蓪?，邊緣出現(xiàn)少量液泡(圖1 -C)。

第Ⅳ時相卵母細胞 卵母細胞體積繼續(xù)增大，卵黃顆粒繼續(xù)增多直至充滿整個核外空間。卵母細胞膜外的濾泡細胞仍為雙層。核仁逐漸溶解在核漿中(圖1 -D、E)。

第Ⅴ時相卵母細胞 核仁消失，細胞質(zhì)中充滿粗大的卵黃顆粒，此時，卵細胞已生理成熟，與濾泡膜分離并游離于卵巢腔中［15］(圖1 -F)。

2.2 卵巢形態(tài)及發(fā)育分期

雌性斑鳠體長為(31.50 ±2.35)cm，體質(zhì)量為(1.20 ± 0.38)kg。養(yǎng)殖條件下斑鳠卵巢(圖1-G)發(fā)育良好，呈“V”型，卵巢外由一層卵巢膜包被，成對位于消化道背上方。在腹腔后端，左右卵巢相連形成一短的輸卵管，經(jīng)泄殖孔開口于體外。繁殖期的卵巢GSI 為(1.28 ±0.12)%。將斑鳠的卵巢發(fā)育分為以下6 個時期。

第Ⅰ期 卵巢呈線狀，微透明，肉眼觀察不能辨別雌雄。經(jīng)組織切片觀察，卵巢內(nèi)主要為第Ⅰ時相卵原細胞。魚類Ⅰ期卵巢終生只出現(xiàn)一次［12］。

第Ⅱ期 卵巢外部形態(tài)加粗，出現(xiàn)微血管，顏色為淺黃色，肉眼不能分辨卵粒，生殖細胞以第Ⅱ時相卵母細胞為主，亦有少量卵原細胞。

第Ⅲ期 卵巢顏色轉(zhuǎn)為黃白色，外形繼續(xù)加粗，卵巢膜上血管發(fā)達，出現(xiàn)分枝，卵粒明顯，經(jīng)肉眼可以辨別。經(jīng)組織切片觀察，以第Ⅲ時相卵母細胞為主，同時有較早期的卵母細胞。

第Ⅳ期 卵巢為長桶狀，外形明顯膨大，呈桔黃色，卵粒飽滿，相互黏連。發(fā)育良好的卵巢以第Ⅳ時相卵母細胞為主，還有少量的第Ⅱ時相、第Ⅲ時相卵母細胞。發(fā)育不良的卵巢，經(jīng)組織切片觀察，仍有大量的第Ⅱ時相、第Ⅲ時相卵母細胞。

第Ⅴ期 卵巢顏色加深為深黃色，表面布滿血管，用手指觸摸松軟，切開卵巢膜觀察，卵粒為圓形，游離在卵腔中。處于此期的雌魚，若輕壓其腹部會有少量卵子流出。此時期卵巢已達生理成熟。

第Ⅵ期 由于所采集的樣本有限，未找到第Ⅵ期卵巢。

2.3 精巢形態(tài)及發(fā)育分期

雄性斑鳠體長為18 ～42 cm，體質(zhì)量為0.5 ～1.2 kg。斑鳠的精巢(圖1 -H)為淡黃色，呈長條狀帶并有小的細梳狀凸起，位于鰾和腎臟兩側(cè)，體積較小，由精巢系膜與體壁相連，左右精巢在尾端合并成“Y”型，形成很短的輸精管，通過泄殖孔與外界相通。繁殖期的精巢GSI 為(0.11 ±0.04)%。從外形上無法判斷發(fā)育至第幾期。斑鳠的精巢同大多數(shù)硬骨魚類相似，屬于小葉型結(jié)構(gòu)。依據(jù)斑鳠精巢組織結(jié)構(gòu)及細胞成分在形態(tài)和數(shù)量上的變化，將斑鳠的精巢發(fā)育分為以下6 個時期。

第Ⅰ期 精巢為細線狀，貼在腹腔壁上，肉眼不能辨別雌雄。此期精巢主要為分布較分散的精原細胞，呈圓形或卵圓形，體積較大。細胞間界限不明顯，細胞核體積大，核膜較清晰，胞質(zhì)較少，偏嗜酸性，染色為淡粉紅色，細胞膜不清晰(圖1 -I)。

第Ⅱ期 精巢仍為細線狀，為淺灰色，精小葉無腔隙，小葉間有結(jié)締組織，精原細胞的數(shù)量明顯增多。此期精巢主要由精母細胞組成，包括初級精母細胞和次級精母細胞。初級精母細胞排列緊密，呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)和核體積減小。次級精母細胞來源于初級精母細胞第一次成熟分裂，細胞體積明顯變小，嗜堿性增強，較初級精母細胞染色深，為藍紫色［16］(圖1 -J)。

第Ⅲ期 精巢為淡粉紅色，出現(xiàn)細微細梳妝凸起，精小葉出現(xiàn)空腔，初級精母細胞、次級精母細胞沿小葉邊緣單層或者多層排列(圖1 -K)。

第Ⅳ期 精巢仍為淡粉紅色，細梳妝凸起明顯，精小葉由初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子組成(圖1 -L)。

第Ⅴ期 精巢為粉紅色，精小葉腔隙擴大，腔隙中充滿了成熟的精子，小葉壁只有少量早期精原細胞。精子呈顆粒狀，細胞核著色甚濃，染色為深紫色，顯微鏡下觀察為黑色小點(圖1 -M)。

第Ⅵ期 切片觀察可見腔隙中大部分精子已經(jīng)排出體外，小葉中只有少量殘存的精子。小葉壁有少量精原細胞和精母細胞(圖1 -N)。

3 討論

3.1 養(yǎng)殖斑鳠性腺發(fā)育的特點

養(yǎng)殖斑鳠在6—8月時，雌魚體色稍呈深褐色，腹部明顯比雄魚膨大而豐滿，手感松弛柔軟，卵巢輪廓明顯，生殖孔和泌尿孔外突稍展開，周圍呈紫紅色，范圍比雄魚大。雄魚體色淡白，腹部平扁，但泄殖孔周圍呈微紅色。解剖發(fā)現(xiàn)，大部分卵巢已達Ⅳ或Ⅴ期，此時距投苗時間大約為2年，說明養(yǎng)殖斑鳠2 齡時就能達到性成熟，這與李紅敬等［17］得出的斑鳠第1次性成熟年齡為6 ～8 齡相差甚大。另外，養(yǎng)殖斑鳠的腹腔脂肪沉積很厚，這可能與長期投喂冰鮮野雜魚和一些脂肪含量高的飼料有關(guān)。斑鳠Ⅰ期精巢和卵巢是從6月齡魚苗取得，但由于樣本數(shù)量有限，其性腺何時出現(xiàn)以及持續(xù)時間不得而知。筆者只對各個時期的精巢和卵巢組織結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)做了描述，至于各個時期的精巢和卵巢從何時開始以及它們的持續(xù)時間還有待進一步研究。

圖1 斑鳠性腺的外觀形態(tài)以及不同時相卵母細胞發(fā)育和精巢發(fā)育分期形態(tài)特征Fig.1 Gonads appearance，and characteristics of oocytes at different stages and characteristics of testis at different stages

3.2 斑鳠生殖細胞發(fā)育的非同步性

魚類卵巢發(fā)育活動可以分為三種類型:完全同步型、分批同步型和非同步型。本研究中發(fā)現(xiàn)，斑鳠在人工馴養(yǎng)條件下卵巢發(fā)育為非同步型。由切片觀察結(jié)果可以看出:處于第Ⅴ期的卵巢中，仍有一部分Ⅲ期、Ⅳ期卵母細胞存在;處于第Ⅳ期的卵巢中，也可以見到大量的Ⅱ期、Ⅲ期卵母細胞。這與石大康［18］對大眼鱖、盛曉灑等［19］對瓦氏黃顙魚的研究結(jié)果相似。通過后期補充采樣結(jié)果可以看出，斑鳠卵巢發(fā)育雖為非同步型，但其產(chǎn)卵類型為一次產(chǎn)卵，斑鳠產(chǎn)卵結(jié)束后，卵巢中雖然仍存在大量的Ⅲ期、Ⅳ期卵母細胞，但發(fā)育到Ⅴ期需要較長的時間和大量的營養(yǎng)積累，斑鳠一次產(chǎn)卵結(jié)束后，需要攝取大量的營養(yǎng)物質(zhì)，為下一年產(chǎn)卵做準備。斑鳠繁殖率低，產(chǎn)卵量少，與其卵巢發(fā)育的不同步性和一次性產(chǎn)卵有直接的關(guān)系。這與董玉蘭等［20］對泰山螭霖魚的研究結(jié)果相似。

3.3 斑鳠的性成熟與繁殖期

采于6—8月的斑鳠樣品，輕壓雌魚腹部，部分有卵液流出，說明此時卵巢已經(jīng)發(fā)育成熟;切片觀察，大部分卵巢處于Ⅳ期或Ⅴ期，通過后期補充采樣驗證，其卵巢發(fā)育情況均不如6—8月采集的斑鳠卵巢發(fā)育良好，說明斑鳠卵巢的成熟期應在6—8月。而性成熟斑鳠同齡雌魚卵巢發(fā)育不同步與其體型大小及營養(yǎng)狀況的關(guān)系，還有待進一步研究。雄性斑鳠精巢細長，曾一度認為其發(fā)育不理想，但通過切片觀察發(fā)現(xiàn)，精巢內(nèi)精子細胞發(fā)育良好，有的甚至充滿整個精小葉腔，由此排除了精巢發(fā)育不良導致斑鳠人工繁殖受精率低的推論，這與朱新平等［21］對池養(yǎng)斑鳠人工繁殖的研究結(jié)果相似。但是，精子的成熟度以及交配時排出精子的量是否是影響斑鳠繁殖率低的原因尚需進一步研究。

［1］陳昆慈，鄔國民，李恒頌，等.珠江斑鳠年齡與生長的研究［J］.中國水產(chǎn)科學，1999，6(4):62 -66.

［2］中國科學院中國動物志編輯委員會.中國動物志 硬骨魚綱 鲇形目［M］.北京:科學出版社，1999:72 -74.

［3］Lei Yang，Shunping He.Phylogeography of the freshwater catfish Hemibagrus guttatus(Siluriformes，Bagridae):Implications for South China biogeography and influence of sea - level changes［J］.Molecular Phylogenetics and Evolution，2008，49:393 -398.

［4］焦宗垚，陳賽，朱新平，等.野生斑鳠西江地理群的遺傳多樣性分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007，15(1):58 -62.

［5］周路，楊凱，楊興，等.野生斑鳠人工繁殖試驗［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2008，36(1):123 -124.

［6］黃玉蘭.利用蚯蚓培育斑鳠大規(guī)格魚種試驗［J］.科學養(yǎng)魚，2008(1):9.

［7］周生禮.山塘套養(yǎng)野生斑鳠試驗［J］.科學養(yǎng)魚，2010(7):33 -34.

［8］余偉暖，姜金忠，彭勇鰲，等.斑鳠爆發(fā)性死亡癥的診斷與防治方法［J］.中國水產(chǎn)，2009(11):54 -55.

［9］鄧國成，江小燕，陳昆慈，等.斑鳠爛鰓病病原菌的研究［J］.水生生物學報，2009，33(3):442 -448.

［10］黃飛鶴，陳琴，陳曉漢，等.斑鳠的含肉率及肌肉營養(yǎng)價值評定［J］.廣西科學，2001，8(2):156 -160.

［11］楊家堅，林勇，陳忠，等.斑鳠親魚營養(yǎng)飼料研制及培育效果的研究［J］.內(nèi)陸水產(chǎn)，2001(3):5 -7.

［12］劉筠.中國養(yǎng)殖魚類繁殖生理學［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1993:22 -40.

［13］樓允東.組織胚胎學［M］.2 版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1994:126 -137.

［14］劉海映，谷德賢，姜玉聲，等.口蝦蛄繁殖周期及生殖細胞發(fā)育的研究［J］.大連海洋大學學報，2013，28(3):269 -272.

［15］李霞.水產(chǎn)動物組織胚胎學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:88 -96.

［16］魏杰，聶竹蘭，李杰，等.塔里木裂腹魚性腺形態(tài)學與組織學的研究［J］.大連海洋大學學報，2011，26(3):227 -231.

［17］李紅敬，褚張杰.斑鳠的生物學特性及養(yǎng)殖技術(shù)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34(22):5882 -5883，5991.

［18］石大康.大眼鱖魚(Siniperca kneri)卵巢發(fā)育的組織學研究［J］.廣西水產(chǎn)科技，1991(4):1 -5.

［19］盛曉灑，刁曉明，李育培，等.嘉陵江瓦氏黃顙魚卵巢組織學的周年變化［J］.淡水漁業(yè)，2009，39(4):3 -11.

［20］董玉蘭，王樹迎.泰山螭霖魚卵巢年周期中卵母細胞發(fā)育及其性腺類固醇激素作用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(6):1264 -1271.

［21］朱新平，陳昆慈，謝剛.池養(yǎng)珠江斑鳠人工繁殖和胚胎發(fā)育的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學院學報，2005，20(4):52 -54.