何旭穎，王冰，張賽賽，沈雙燁，謝喚，王偉

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

太平洋鱈Gadus macrocephalus Tilesius 俗名大頭鱈，隸屬于硬骨魚綱Osteichthves、鱈形目Gadiformes、鱈科Gadidae、鱈屬Gadus，是典型的冷水性魚類，分布于太平洋北部沿岸海域，多棲息于大陸架和大陸斜坡上部水深10 ～550 m 的海域中。中國的太平洋鱈主要產(chǎn)于黃海，一般棲息于水深為50 ～80 m 的泥沙或軟泥底質(zhì)海區(qū)［1］。太平洋鱈是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚類之一，其肉質(zhì)白細(xì)鮮嫩、清口不膩，呈蒜瓣?duì)?，是鱈科魚類中的主要捕撈對(duì)象［1］。目前，國外已經(jīng)形成了一套完整的大西洋鱈人工繁殖和養(yǎng)殖模式，太平洋鱈已成為北歐、北美等諸多國家新的重要養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加［2-3］。太平洋鱈的人工育苗技術(shù)雖然在國外已經(jīng)獲得成功，但在中國尚未獲得突破。國內(nèi)對(duì)太平洋鱈的系統(tǒng)研究甚少［1，4-6］，僅有少量關(guān)于其生物學(xué)的初步研究［7］。

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)屬于溴系阻燃劑的一種，被廣泛應(yīng)用于電子、電器、化工等領(lǐng)域中［8］。PBDEs 具有一定的揮發(fā)性，可隨大氣長距離遷移，且親脂性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可隨食物鏈生物富集和放大，是一種持久性有機(jī)污染物［9］。十溴聯(lián)苯醚(BDE -209)是國內(nèi)產(chǎn)量最大、最具代表性的高分子含溴阻燃劑［10-12］。目前，PBDEs 對(duì)海洋環(huán)境的影響已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。中國對(duì)PBDEs 的研究起步較晚，對(duì)PBDEs在環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化的研究雖取得了一些成果，但對(duì)PBDEs 的生物毒理研究才剛剛起步。

國內(nèi)關(guān)于環(huán)境持久性有機(jī)污染物對(duì)魚類毒性的研究主要集中在其對(duì)生物體本身的毒性作用以及對(duì)生物體遺傳毒性方面，而有關(guān)其對(duì)魚類精子影響方面的研究尚屬空白。生物的精子活力、精子運(yùn)動(dòng)能力對(duì)受精率具有重要的影響［13-14］。而對(duì)于體外受精種類而言，研究持久性有機(jī)污染物對(duì)其精子形態(tài)、存活率等的影響，顯得尤為重要。目前，對(duì)于PBDEs 毒性研究的相關(guān)試驗(yàn)大多是單一的針對(duì)PBDEs在短周期、高劑量暴露下的生物效應(yīng)的研究，而根據(jù)環(huán)境中存在的多溴聯(lián)苯醚濃度設(shè)置試驗(yàn)濃度的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道［15］。本試驗(yàn)中，根據(jù)環(huán)境中多溴聯(lián)苯醚的含量進(jìn)行不同試驗(yàn)濃度的設(shè)置，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察太平洋鱈精子的超微結(jié)構(gòu)，研究不同濃度的十溴聯(lián)苯醚對(duì)其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，旨在豐富太平洋鱈的相關(guān)生物學(xué)研究內(nèi)容，為海水中十溴聯(lián)苯醚安全含量的監(jiān)測(cè)以及探究十溴聯(lián)苯醚的毒性機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑 十溴聯(lián)苯醚購自百靈威試劑公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海生工有限公司，其余試劑均購自沈聯(lián)試劑公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 精液來源 雄性太平洋鱈購自大連市黑石礁市場，2 ～4 齡，體長為30 ～60 cm。選擇體質(zhì)健壯、無傷病的太平洋鱈作為試驗(yàn)對(duì)象，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。取樣時(shí)先用蒸餾水沖洗太平洋鱈泄殖腔，再用干毛巾將泄殖腔周圍擦干，輕壓腹部，收集精子。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分為7 組，即對(duì)照組、DMSO 對(duì)照組和5 個(gè)十溴聯(lián)苯醚試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行，各組試劑濃度見表1。對(duì)照組采用自然海水。取適量太平洋鱈精子放于100 mL 燒杯中(鏡檢精子密度為105個(gè)/mL，存活率＞90%)，進(jìn)行暴露，并分別在暴露后2、4、8、12 h 時(shí)取樣，每次取1 mL 精液，以2000 r/min 離心10 min，去除上清液，然后沿管壁小心加入等體積2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛固定，于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)各組十溴聯(lián)苯醚和DMSO 暴露濃度的設(shè)置Tab.1 The concentrations of decabromodiphenyl ethers and DMSO in the experiment

1.2.2 掃描電鏡(SEM)樣品的制備 用0.1 mol/L PBS 洗滌精子3次，每次浸洗10 ～15 min，用梯度叔丁醇脫水處理，分兩個(gè)階段進(jìn)行，第一階段的叔丁醇分別為50%、70%、80%、90%、95%(體積分?jǐn)?shù))，各級(jí)脫水處理10 min;第二階段用純叔丁醇脫水3次，每次10 min。將經(jīng)脫水處理后的精子連帶叔丁醇置于冰箱(4 ℃)中，待叔丁醇變?yōu)楣虘B(tài)時(shí)，再將其轉(zhuǎn)至真空抽濾瓶中進(jìn)行真空干燥。將干燥的精子粘貼于有導(dǎo)電膠的金屬樣品臺(tái)上，用離子噴涂儀在精子樣品表面均勻鍍一層能夠?qū)щ姷慕鹉?，并置于掃描電鏡下觀察并拍照。

1.2.3 透射電鏡(TEM)樣品的制備 用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸雙重固定，用梯度乙醇脫水、樹脂包埋、AO 超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，在JEOL 1200EX 電鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 太平洋鱈正常精子的形態(tài)

在電子顯微鏡下觀察，對(duì)照組、DMSO 對(duì)照組、0.5 ng/L 濃度組、5 ng/L 濃度組、50 ng/L 濃度組和500 ng/L 濃度組的太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)大部分形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)基本完整(圖1)。在掃描電鏡下觀察，正常精子細(xì)胞表面比較均勻、光滑，主要由頭部、中段和尾部3 部分組成(圖1 -A、B);在透射電鏡下觀察，精子質(zhì)膜完整，細(xì)胞核連續(xù)，核染色質(zhì)致密而均勻。

在掃描電鏡下觀察，精子頭部呈卵圓形，長徑為(2.334 ± 0.044)μm，短徑為(1.422 ±0.285)μm，主要結(jié)構(gòu)是細(xì)胞核(圖1 -C)。在透射電鏡下觀察，細(xì)胞核染色質(zhì)致密，由核膜包被，核前方無頂體，核后方有一植入窩，植入窩較深，為細(xì)胞核的1/2 ～3/4(圖1 -I)。

在透射電鏡下觀察，精子中段由中心粒復(fù)合體和袖套組成(圖1 -H)。中心粒復(fù)合體位于植入窩內(nèi)，包括近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒(基體)，近端中心粒位于植入窩的前端，由9 組三聯(lián)微管組成，基體位于植入窩后端，與近端中心粒呈“T”字形(圖1-I、J)。袖套呈筒狀，中央的腔即為袖套腔，袖套腔較狹窄(圖1 -E、I)。袖套中包括4 ～6 個(gè)線粒體，呈不規(guī)則排列，線粒體的雙膜層和內(nèi)嵴均清晰可見，基質(zhì)較疏松(圖1 -K、G)。

在透射電鏡下觀察，由基體發(fā)出的軸絲向后延伸并連同少量的細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成精子的鞭毛，此為精子的尾部。鞭毛長度為(28.078 ±3.573)μm，直徑為(0.206 ±0.250)μm，鞭毛橫切面略呈圓形，外由一層膜包圍，內(nèi)由軸絲和微管系統(tǒng)組成，微管結(jié)構(gòu)為典型的“9+2”雙聯(lián)微管結(jié)構(gòu)(圖1 -F)。尾部外表面有由質(zhì)膜向兩側(cè)突出而形成的側(cè)鰭(圖1 -D)。

圖1 太平洋鱈正常精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of nomal spermtozoa in Pacific cod Gadus macrocephalus Tilesius

2.2 太平洋鱈異常精子的形態(tài)

暴露于高濃度十溴聯(lián)苯醚(5000 ng/L)的太平洋鱈精子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一些不同程度的異常，主要體現(xiàn)在精子質(zhì)膜、細(xì)胞核、線粒體和鞭毛的變化上，其中暴露2 h 時(shí)試驗(yàn)組的精子形態(tài)基本完整，4、8、12 h 時(shí)試驗(yàn)組精子的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變(圖2)。

在掃描電鏡下觀察，暴露于高濃度十溴聯(lián)苯醚(5000 ng/L)2 h和4 h 時(shí)的精子形態(tài)基本完整，與對(duì)照組相比無顯著變化;8 h 時(shí)精子細(xì)胞核表面出現(xiàn)白色結(jié)晶狀病變(圖2 -A);12 h 時(shí)精子細(xì)胞核破裂、變形，線粒體減少，可見鞭毛斷裂痕跡(圖2 -B)。在透射電鏡下觀察，暴露2 h 時(shí)大多數(shù)精子形態(tài)與對(duì)照組相比無顯著變化;4 h 時(shí)偶有質(zhì)膜膨脹表現(xiàn)，線粒體移位，其他結(jié)構(gòu)均完整(圖2 -C);8 h 時(shí)出現(xiàn)精子質(zhì)膜破裂，線粒體部分膜結(jié)構(gòu)受損，內(nèi)嵴斷裂，甚至溶解，基質(zhì)變淺，呈空泡樣(圖2 -D、E)，鞭毛偶有斷裂;12 h 時(shí)大多數(shù)精子質(zhì)膜消失，鞭毛大量脫落、堆積(圖2 -F)，部分微管結(jié)構(gòu)解體，甚至消失(圖2 - H)，線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)基本消失(圖2 -G)。

圖2 高濃度組(5000 ng/L)太平洋鱈異常精子的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of spermtozoa of Pacific cod Gadus macrocephalus exposed to 5000 ng/L decabromodiphenyl

3 討論

3.1 太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)的變化與功能的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚對(duì)太平洋鱈的質(zhì)膜、細(xì)胞核、線粒體和鞭毛均有不同程度的損傷作用。暴露4 h 時(shí)，高濃度組精子開始出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，隨著時(shí)間的延長，變化更為明顯，如細(xì)胞質(zhì)膜破裂，甚至消失，細(xì)胞核變形，線粒體空泡狀等。

精子細(xì)胞膜的組成與一般細(xì)胞膜相似，由糖蛋白和磷脂組成，其中磷脂是精子細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑，磷脂的改變，對(duì)精子的代謝、獲能、受精，以及藥物毒性的滲入有重要意義［16-17］。本試驗(yàn)中，高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚即可損壞精子的細(xì)胞膜，破壞膜的完整性和穩(wěn)定性，使毒物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而破壞精子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，抑制精子的活動(dòng)能力，甚至殺死精子，影響受精率。

線粒體是氧化磷酸化的主要部位，其中含有脫氫酶和三磷酸腺苷酶(ATP)［18］。精子運(yùn)動(dòng)的能量主要來自于線粒體，可見線粒體的完整性對(duì)于精子的活力至關(guān)重要。高濃度十溴聯(lián)苯醚可使精子中段線粒體變形，嵴溶解，呈空泡樣，從而使ATP 酶的產(chǎn)生受阻，能源枯竭，進(jìn)而嚴(yán)重影響精子的活力。本試驗(yàn)結(jié)果證明，有機(jī)污染物對(duì)精子活力影響的一個(gè)重要方面是來自于對(duì)線粒體的損害，影響供能，進(jìn)而影響精子活力，這是研究持久性有機(jī)污染物對(duì)精子影響的一個(gè)重要突破。

鞭毛為精子的主要運(yùn)動(dòng)器官，精子尾部的擺動(dòng)能使精子運(yùn)動(dòng)，而與尾部運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的是中央軸絲，即中央2 對(duì)和外周9 對(duì)微管結(jié)構(gòu)。尾部的擺動(dòng)是由每對(duì)二聯(lián)微管之間的相對(duì)滑動(dòng)引起的，二聯(lián)微管上的纖毛蛋白臂中含有大量的ATP 酶，可以水解ATP 以供給能量［18］。本試驗(yàn)中，暴露于高濃度(5000 ng/L)十溴聯(lián)苯醚中8 h和12 h 時(shí)，太平洋鱈精子均出現(xiàn)鞭毛異?，F(xiàn)象，12 h 時(shí)鞭毛大量脫落，軸絲微管結(jié)構(gòu)解體，甚至消失，從而使精子失去了運(yùn)動(dòng)能力。而12 h 時(shí)精子的線粒體也基本萎縮，內(nèi)嵴消失，失去了供能的能力。由此可認(rèn)為，太平洋鱈精子在濃度為5000 ng/L 的十溴聯(lián)苯醚中暴露12 h 時(shí)基本可以被完全殺死。

通過本試驗(yàn)結(jié)果可以推出十溴聯(lián)苯醚對(duì)太平洋鱈精子的主要影響:(1)破壞精子質(zhì)膜;(2)破壞線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu);(3)破壞精子的鞭毛，損傷軸絲微管系統(tǒng)。

3.2 十溴聯(lián)苯醚的毒性及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

多溴聯(lián)苯醚是一類重要的溴代阻燃劑，含量從5%到30% 不等［19］，其中十溴聯(lián)苯醚(PBDE -209)是中國國內(nèi)產(chǎn)量最大的含溴阻燃劑［10-12］。目前，六溴聯(lián)苯醚、七溴聯(lián)苯醚、四溴聯(lián)苯醚、五溴聯(lián)苯醚已被列入禁用名單，其中四溴聯(lián)苯醚的毒性最大。雖然十溴聯(lián)苯醚毒性不如四溴聯(lián)苯醚劇烈，但隨著近些年來電子電器產(chǎn)業(yè)突飛猛進(jìn)，十溴聯(lián)苯醚作為高效的含溴阻燃劑在國內(nèi)大量生產(chǎn)使用，電子廢棄物等的大量排放造成環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，因此，其在環(huán)境中的毒性累積作用也不容忽視。

研究表明，海洋、河口地區(qū)水中PBDE -209的質(zhì)量濃度范圍一般在0.05 ～65.20 ng/L［20-23］。本試驗(yàn)中根據(jù)此濃度范圍設(shè)置5 個(gè)濃度，即0.5、5、50、500、5000 ng/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為0.5、5、50、500 ng/L 的十溴聯(lián)苯醚對(duì)太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)無顯著性影響，而濃度為5000 ng/L 十溴聯(lián)苯醚對(duì)太平洋鱈精子超微結(jié)構(gòu)影響顯著。由此可得出，當(dāng)海洋中十溴聯(lián)苯醚含量達(dá)到5000 ng/L 時(shí)，即可以殺死大部分精子，影響海洋生物的受精，進(jìn)而引起海洋中生物的減少，極有可能導(dǎo)致該物種的消亡。盡管目前環(huán)境中的十溴聯(lián)苯醚濃度達(dá)不到5000 ng/L，但是在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，不僅只有一種污染物獨(dú)立存在，而是幾種污染物同時(shí)存在，同時(shí)起作用［22］，眾多的污染物勢(shì)必會(huì)在達(dá)到某一個(gè)界限時(shí)引發(fā)精子的致畸和死亡。另一方面，人和動(dòng)物暴露于PBDEs 的主要途徑是通過食物鏈的傳遞作用［24-25］。PBDEs 屬于非離子型化合物，其持久性強(qiáng)、水溶性低，與顆粒物具有很強(qiáng)的親和性，易在沉積物和生物體內(nèi)累積［26-27］。因此，PBDEs 的累積作用也不容忽視，PBDEs在生物體內(nèi)長久累積，當(dāng)其達(dá)到一定的濃度值時(shí)，勢(shì)必會(huì)引起對(duì)生物體的毒性作用，對(duì)于此方面的深入研究應(yīng)給予足夠的重視。而本試驗(yàn)中所研究的十溴聯(lián)苯醚，也可與其他多溴聯(lián)苯醚同系物之間，包括與其他污染物(如多氯聯(lián)苯、多氯化萘等)之間形成多種環(huán)境污染物，其是否具有協(xié)同效應(yīng)，目前還沒有確切的報(bào)道。因此，上述環(huán)境持久性有機(jī)污染物的聯(lián)合作用方式、作用部位，以及劑量-效應(yīng)之間的關(guān)系等還有待進(jìn)一步研究。

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