劉振川，孫 巖 ，何玉祥，劉 洋 ，周 華 ，王茂華，袁 海 ，金 星

近年來，下肢動脈缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為引起肢體壞疽甚至下肢截肢的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者健康［1-2］。如何有效改善下肢血供，降低下肢缺血性疾病的截肢率，改善患者的生活質(zhì)量，是血管外科目前面臨的重要課題。筆者所在科室多年來將自行配制的中藥藥液——參黃液應(yīng)用于下肢缺血性疾病的治療，主要外用于壞疽肢端和缺血肢體的局部。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察參黃液對肢體缺血性疾病的治療效果，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠90只［由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號:SCXK(17/11)20120003］，8 周齡，體重250 ～300 g。

1.2 試藥與試劑

1.2.1 參黃液的配制:將丹參、丹皮、黃檗、苦參、黃連按一定比例用75%乙醇浸泡1周后待用。

1.2.2 試劑:月桂酸(Sigma Aldrich)。生物素化二抗工作液(過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素染色試劑盒):山羊多抗，通用型SP Kit工作液，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，產(chǎn)品編號:SP-9002。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)一抗:小鼠多抗，Santa Cruz Biotechnology公司生產(chǎn)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號:SC-7269。

1.3 方法

1.3.1 造模與分組:采用日本學(xué)者Ashida等［3］的方法復(fù)制后肢缺血大鼠模型，具體方法:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3．5 ml/kg)進(jìn)行麻醉，在顯微鏡輔助下行后肢股動脈穿刺，注入月桂酸0．2 ml(濃度10 mg/ml)。給藥后大鼠后肢逐漸出現(xiàn)腫脹、皮色皮溫改變、壞疽等表現(xiàn)，表明造模成功。將造模成功后的90只大鼠隨機(jī)分為空白對照組(A組)、75%乙醇治療組(B組)及參黃液治療組(C組)，每組30只。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0．05)，具有可比性。

1.3.2 治療方法:造模后立即開始給藥處理［4］。A組不做任何處理，B組用75%乙醇浸泡造模側(cè)后肢，早晚各1次，每次15 min;C組用參黃液浸泡造模側(cè)后肢，早晚各1次，每次15 min。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肢體缺血程度評價:造模后第21天，觀察大鼠造模側(cè)后肢的皮色、皮溫、動脈搏動情況，以及患肢有無腫脹、繼發(fā)感染、壞疽和木乃伊化，并將觀察結(jié)果分組詳細(xì)記錄。肢體缺血程度評分標(biāo)準(zhǔn)［5］:肢體正常，無缺血為0分;趾端蒼白或行走姿態(tài)異常為1分;出現(xiàn)壞疽，但壞疽范圍不超過半足，且肢體其他部位無壞疽為2分;出現(xiàn)壞疽但壞疽范圍不超過半足，且伴有肢體其他部位壞疽為3分;肢體壞疽范圍超過半足為4分;壞疽范圍超過膝(肘)關(guān)節(jié)為5分。

1.4.2 平均微血管密度(MVD)測定:造模后第21天處死大鼠并留取造模側(cè)后肢肌肉標(biāo)本，對所有標(biāo)本進(jìn)行MVD檢測，CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮，計數(shù)MVD采用Weidner［6］方法:在40倍光鏡下掃查整個切片，尋找血管高密度區(qū)(熱點(diǎn))，在400倍視野下計數(shù)3個視野被染成棕色的血管數(shù)，取平均值作為MVD值。

1.4.3 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢測:應(yīng)用免疫組化SABC法檢測VEGF相關(guān)抗原的表達(dá)情況，其陽性表達(dá)為肌肉細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒［7］。利用免疫組化圖像分析系統(tǒng)對組織切片進(jìn)行圖像分析，每例選5張組織切片，首先于低倍鏡下找出5個著色最深的區(qū)域(熱點(diǎn))，再對這些區(qū)域進(jìn)行數(shù)字圖像處理，測出積分光密度后取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn);等級計數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肢體缺血程度比較 C組肢體缺血程度與A、B組比較明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=－2．672，P=0．002;Z= －1．985，P=0．021)，A、B組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=－0．677，P=0．239)。見表 1。

表1 3組大鼠肢體缺血程度評分結(jié)果

2.2 MVD比較 免疫組化毛細(xì)血管染色在高倍鏡(400×)下觀察得到 A、B、C組標(biāo)本 MVD分別為(4．00 ±1．31)、(4．00 ±1．11)、(5．00 ±1．23)根。C組MVD明顯高于A、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2．135，P=0．031;t=2．067，P=0．026)，但 A、B 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．002，P=5．127)。

2.3 VEGF陽性表達(dá)比較 3組造模側(cè)后肢內(nèi)收肌標(biāo)本均可檢測到VEGF蛋白的陽性表達(dá)，C組表達(dá)呈強(qiáng)陽性，B組表達(dá)較C組弱，A組幾乎無表達(dá)(圖1～3)。圖像分析顯示，A、B、C組積分光密度分別為6401．11 ±397．22、6345．96 ±406．50、6719．61 ±323．84，C組高于 A、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2．601，P=0．022;t=2．733，P=0．021)，A、B 組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0．001，P=8．235)。

3 討論

近年來，隨著高血壓病、冠心病、高脂血癥的發(fā)病率不斷升高，隨之由動脈粥樣硬化引起的下肢缺血性疾病也逐漸增多，已成為下肢缺血性壞疽甚至截肢的主要原因之一［2］。肢端壞疽是糖尿病晚期的嚴(yán)重并發(fā)癥，也成為下肢截肢的重要因素。在有大量吸煙史的青壯年人群中，血栓閉塞性脈管炎(TAO)是導(dǎo)致其截肢的最常見血管疾?。?］。此外，急性動脈栓塞若治療不及時，亦可導(dǎo)致肢體壞死甚至截肢［1］。

圖1 3組大鼠造模側(cè)后肢內(nèi)收肌標(biāo)本血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)(SABC法×100)

如何改善肢體缺血癥狀，避免肢端壞疽造成的截肢是血管外科目前面臨的難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。臨床常用的治療手段有藥物治療、手術(shù)治療、介入治療、基因治療和干細(xì)胞移植等，這些方法單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均取得了良好的效果［9-13］。但對于已發(fā)生壞疽的肢端和缺血肢體如何進(jìn)行有效的局部處理，則長期被臨床醫(yī)生所忽視。壞疽肢端和缺血肢體的局部很容易繼發(fā)感染，一旦發(fā)生會影響下一步的治療，形成惡性循環(huán)，若處理不當(dāng)很容易導(dǎo)致截肢。因此，對于壞疽肢端和缺血肢體的局部處理應(yīng)成為肢體動脈缺血性疾病治療中的重要環(huán)節(jié)。朱長庚［14］、王軍等［15］應(yīng)用中藥浸泡缺血的指(趾)端，發(fā)現(xiàn)可以明顯減少壞死范圍，為后續(xù)治療創(chuàng)造了有利條件。

筆者所在科室將丹參、丹皮、黃檗、苦參、黃連按一定比例用75%乙醇浸泡1周后制作成參黃液，用于浸泡肢體動脈缺血性疾病患者的壞疽肢端和缺血肢體，臨床隨訪觀察表明，該療法不但可以促進(jìn)缺血肢體側(cè)支循環(huán)的建立，而且可以有效防止繼發(fā)感染，從而降低截肢平面，并且在一定程度上緩解缺血導(dǎo)致的肢體疼痛。因主要為外用，該藥在使用過程中幾乎無任何不良反應(yīng)，但目前參黃液外用對缺血肢體的治療機(jī)制尚未見報道。

本研究通過建立大鼠后肢缺血模型，進(jìn)一步證實(shí)了參黃液對缺血肢體的治療作用，而且初步揭示了其作用機(jī)制。對組織切片的分析表明，C組MVD顯著高于A、B組，提示參黃液可以有效促進(jìn)缺血肢體組織中毛細(xì)血管的生成，從而建立側(cè)支循環(huán)。

VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白，通過結(jié)合特異性受體導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，延長其存活時間和增加血管通透性，從而調(diào)節(jié)血管的生長，促進(jìn)新生血管和淋巴管的形成［16-18］。本研究結(jié)果顯示，參黃液可以有效促進(jìn)大鼠缺血組織標(biāo)本VEGF蛋白的表達(dá)，免疫組化分析顯示，應(yīng)用參黃液的C組VEGF蛋白表達(dá)為強(qiáng)陽性，其積分光密度也顯著高于A、B組。從蛋白水平證實(shí)參黃液可以上調(diào)缺血肢體組織中VEGF蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)患肢局部側(cè)支循環(huán)的建立以發(fā)揮治療作用，為揭示參黃液的作用機(jī)制提供了重要線索。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了參黃液對肢體缺血性疾病的治療作用，初步揭示了參黃液是通過調(diào)節(jié)VEGF蛋白的表達(dá)、促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立而起到治療作用。不僅證實(shí)了參黃液是一種可以應(yīng)用于臨床處理壞疽肢端和缺血肢體局部的有效藥物，而且為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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