劉 焱，陳桂平，張繼紅，盧 君

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南省食品質量監(jiān)督檢測所，湖南 長沙 410002）

魚肉味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等優(yōu)點，營養(yǎng)平衡性好，是人體攝取動物蛋白質的重要來源之一。我國淡水魚資源豐富，但生產(chǎn)季節(jié)性強，并且魚肉極易腐敗變質，所以魚肉的保鮮貯藏顯得尤其重要。魚肉在貯藏過程中新鮮度會不斷降低，發(fā)生蛋白質變性、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）降解、脂肪氧化等，魚肉風味的損失、苦味的增加、口感品質的降低與這些變化密切相關[1]。

ATP代謝關聯(lián)物是魚肉中重要的呈味物質。魚在死后會發(fā)生酶催化ATP的降解反應，依次降解為腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）。其中，肌苷酸是一種鮮味化合物，目前已作為衡量肉質鮮味的重要指標，最終產(chǎn)物次黃嘌呤會產(chǎn)生苦味影響口味，而AMP有壓抑苦味的特性，是種良好的風味增強劑[2-4]。目前淡水魚貯藏過程中品質變化研究都集中于魚肉蛋白質的變性和揮發(fā)性風味成分的變化，關于呈味核苷酸的研究很少且不完善，對草魚肉中呈味核苷酸的分析研究更是空白。因此本研究通過分析草魚冷藏期間呈味核苷酸含量的變化，結合新鮮度指標揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的檢測和綜合感官評價，找出草魚肉中各核苷酸的含量與其新鮮度的相關性，以期能為草魚在冷藏期間風味品質的保證提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮草魚兩條，2 kg左右，體長約60 cm，購于長沙高橋菜市場。

ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx標準品 德國Ruibio公司；甲醇為色譜純；高氯酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氧化鎂、硼酸、鹽酸、乙醇、甲基紅、次甲基藍（均為分析純） 國藥集團化學試劑公司。

FSH-2A高速勻漿機 金壇市國旺實驗儀器廠；TMP-510電子分析天平 湘儀天平儀器公司；LD5-2A離心機 北京醫(yī)用離心機廠；1100高效液相色譜 美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將新鮮的草魚去頭、尾、鱗、內臟后，去骨采背部肉，制成魚塊置于4 ℃冰箱中保存待用。分別于冷藏后2、4、6 d取樣，進行高效液相色譜分析和TVB-N含量檢測。

1.2.2 ATP關聯(lián)物含量的測定

1.2.2.1 草魚ATP關聯(lián)物的提取與轉化[5-8]

取新鮮草魚肉與冷藏后2、4、6 d的樣品，切碎后取10 g放入離心管，加入預冷后的5%高氯酸溶液20 mL，勻漿后預冷10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用5%高氯酸洗滌重新離心取上清液。合并上清液，用NaOH飽和溶液調pH值為7.8[9]，靜置5 min后過濾至100 mL容量瓶，超純水定容后過0.45 μm待用。

1.2.2.2 ATP關聯(lián)物梯度質量濃度混合標準液的配制

單樣標準品（1 mg/mL）：稱取25 mg分別定容至25 mL容量瓶中定容；混合標準品（100 μg/mL）：吸取6 種單樣標準品各1 mL至10 mL容量瓶中定容；混合標準品（50、20、10、5 μg/mL）：分別吸取100 μg/mL的混合標準品5、2、1、0.5 mL至10 mL容量瓶中定容。

1.2.2.3 ATP關聯(lián)物的高效液相色譜檢測[5,10-12]

高效液相色譜（highper for manceliquid chromatography，HPLC）條件：色譜柱Capcellpak C18（4.6 mm×150 mm），0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇（90∶10，V/V）等度洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長260 nm，流速0.8 mL/min，上樣量10 μL。通過比較樣品和標準化合物的保留時間和峰面積來確定ATP關聯(lián)物的種類和含量。

1.2.2.4 計算公式

式中：m為樣品核苷酸鈉鹽的檢測含量/（mg/kg）；M核苷酸、M核苷酸鈉鹽分別為核苷酸和核苷酸鈉鹽的相對分子質量。

1.2.3 TVB-N含量的測定

按GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》[13]規(guī)定的方法檢測，每個樣品做3 個平行，計算其平均值。

1.2.4 感官評價

參考楊文鴿等[14]的方法略作修改。感官評價以草魚肉塊的色澤、氣味、組織結構和彈性，水煮魚塊的氣味、滋味和湯汁形態(tài)作為指標。感官評定人員由隨機抽取15 名人員組成，分別對生魚塊和水煮魚塊6 個指標進行評分，評定人員需在感官評定半小時前鹽水漱口。每一指標取平均分后按生魚塊和水煮魚塊分別統(tǒng)計后再按總分10 分制計分。水煮魚塊定量25 g肉加250 mL純凈水加蓋煮沸8 min[15]。具體評分標準見表1。

2 結果與分析

2.1 ATP關聯(lián)物混合標準品的標準曲線和回歸方程

表1 冷藏草魚塊感官評定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of grass carp

圖1 ATP關聯(lián)物混合標準品的標準曲線和回歸方程Fig.1 Standard curves and regression equations for ATP-related compounds

2.2 ATP關聯(lián)物混合標準品和魚肉樣品的HPLC圖譜

圖2 混合標準品（20 μg/mL）HPLC圖譜Fig.2 HPLC pro file of mixed standards (20 μg/mL)

圖2為含有6 種標準化合物ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx的高效液相色譜圖譜，出峰的先后順序為ATP-2Na（3.580 min）、IMP-2Na（3.867 min）、ADP-2Na（4.113 min）、AMP-Na（6.066 min）、Hx（6.736 min）、HxR（7.150 min）。在本色譜條件下，ATP系列關聯(lián)物8 min內就能得到有效分離，楊文鴿[14]、劉亞[12]等的分離時間為35 min，戚曉玉[16]、伍彬[17]等的分離時間在30 min左右?？梢妼⒉环€(wěn)定的ATP系列化合物轉化成其鈉鹽形式，不僅方便其檢測并且大大縮短了分離時間，其重現(xiàn)性效果也好。

圖3 新鮮草魚肉樣品HPLC圖譜Fig.3 HPLC pro file of ATP-related compounds from fresh grass carp meat

經(jīng)過圖3峰值計算，新鮮草魚肉中ATP含量為273.17 mg/kg、ADP含量為95.22 mg/kg、IMP含量為504.34 mg/kg、AMP含量為62.38 mg/kg、HxR含量為51.76 mg/kg、Hx含量為8.62 mg/kg。從圖3可以看出，新鮮草魚肉中IMP含量明顯高于其他關聯(lián)物。IMP的含量對肉的滋味和香味都有重要影響，是畜、禽和魚肉中的主要鮮味化合物[18-20]，新鮮草魚肉質鮮美與高含量的IMP密切相關。

圖4 新鮮煮制草魚肉樣品HPLC圖譜Fig.4 HPLC pro file of ATP-related compounds from cooked fresh grass carp meat

由圖4經(jīng)過峰面積計算，煮制的新鮮草魚肉中ATP含量為281.62 mg/kg、ADP含量為177.68 mg/kg、IMP含量為654.35 mg/kg、AMP含量為80.99 mg/kg、HxR含量為34.44 mg/kg、Hx含量為4.84 mg/kg。煮制的新鮮草魚肉中IMP含量也明顯高于其他關聯(lián)物。與未煮制的新鮮草魚肉相比較，ATP含量稍有增加，ADP含量增加了86.60%、IMP含量增加了29.74%、AMP含量增加29.83%、HxR含量減少33.46%、Hx含量減少43.85%。經(jīng)過煮制的草魚肉中促進風味作用的ATP關聯(lián)物含量都有所增加，產(chǎn)生苦味的Hx含量則明顯下降，說明加工過程可以影響魚肉風味物質含量的變化從而改變魚肉的口感。

2.3 草魚冷藏期間ATP關聯(lián)物含量的變化

圖5 草魚冷藏期間ATP、ADP、IMP（A）和AMP、Hx、HxR（B）含量的變化Fig.5 Changes in the levels of ATP, ADP, IMP, AMP, Hx, and HxR in grass carp meat during cold storage

從圖5可看出，冷藏過程中含量下降最快、下降幅度最大的為ATP和IMP。ATP只在新鮮的魚肉中檢測到，冷藏第2天就已檢測不出其含量。ATP含量的快速下降跟魚死后其合成受阻和高活性的ATP酶快速降解有關，并且Watabe等[21]研究認為，在較低的貯藏溫度條件下肌漿網(wǎng)狀結構的鈣吸收能力下降，肌原纖維內鈣濃度增加，鈣離子能激活肌原纖維Mg2+-ATP酶，加速ATP的降解。在冷藏第2天，IMP從504.34 mg/kg下降到36.48 mg/kg，下降幅度達92.77%，此后一直呈緩慢下降趨勢。有研究[2]以雞肉為例，屠宰后在4 ℃保存約8 h時，IMP含量最多，此后逐漸減少，與本研究含量變化基本一致。IMP與谷氨酸鈉對鮮味有相乘效應，混合存在時增味效果明顯增強。作為重要的鮮味化合物，新鮮魚肉和冷藏魚肉中IMP含量的巨大差異可以從風味方面解釋冷藏魚肉口味為何不如新鮮魚肉。

圖5還顯示，ADP在冷藏周期內含量先上升后下降，總體變化不大。AMP的含量一直維持在一個平穩(wěn)的水平。這都與ATP的降解有關。伍彬等[17]認為，AMP有壓抑苦味的特性，能使食物產(chǎn)生理想的甜味和咸味，是種良好的風味增強劑。圖5顯示在冷藏第2天，Hx含量從8.62 mg/kg上升84.64 mg/kg，上升幅度達到89.82%，此后一直維持較高的含量。HxR的含量則一直呈下降趨勢，從新鮮魚51.76 mg/kg一直下降到24.17 mg/kg。Hx為ATP降解途徑中的最終產(chǎn)物，前體物質的快速降解導致了Hx含量的快速上升，這與魚體開始出現(xiàn)細菌腐敗分解密切相關[22-23]。Hx被認為可導致食物苦味，使魚的風味變差[24]。

2.4 草魚冷藏期間總TVB-N含量的變化

圖6 草魚冷藏期間TVB-N含量的變化Fig.6 Changes in TVB-N contents in grass carp meat during cold storage

如圖6所示，草魚冷藏過程中總TVB-N含量呈上升趨勢。新鮮時含量為5.52 mg/100 g，冷藏2 d時含量為10.32 mg/100 g，4 d時為17.24 mg/100 g，第6天為32.07 mg/100 g。TVB-N含量與魚肉蛋白質自溶和細菌繁殖分解相關。冷藏過程中低溫有抑制酶活與細菌繁殖的作用，貯藏初期魚肉蛋白質緩慢自溶水解。隨著貯藏時間的延長，其降解的大量產(chǎn)物為微生物的生長提供了天然的培養(yǎng)基，細菌開始大量繁殖，使氨基酸脫羧基或氨基生成胺類、氨氣等異味物質。因此冷藏6 d時，魚肉在內外環(huán)境的作用下產(chǎn)生大量TVB-N。魚類TVB-N的量達到30 mg/100 g時[20]，即被認為是變質的標志，實驗結果可以認為魚肉的冷藏周期在6 d以內。

2.5 草魚冷藏期間的感官評定

圖7 冷藏期間生魚肉（A）和熟魚肉（B）感官評定Fig.7 Sensory evaluation of raw grass carp (A) and cooked grass carp meat (B) during cold storage

從圖7A可以看出，生魚肉在冷藏2 d后較新鮮魚感官有所下降，在冷藏2～4 d感官變化不太明顯，但在第4天后呈明顯下降。從圖7B可以看出，隨著貯藏時間的延長，魚肉煮制后的感官評定明顯下降趨勢。

剛宰殺的新鮮魚肉表面濕潤光滑，顏色鮮白紅潤，有清淡的青草味，些許腥味但氣味柔和，用手指輕壓后凹陷立即回復；經(jīng)水煮后肉香味濃郁，湯汁清澈，入口肉質細嫩有彈性。冷藏2 d后魚肉表面開始發(fā)干，色澤正常但光澤度低；煮制后肉香味明顯但不如新鮮魚肉鮮美，湯汁清晰但表面有少許漂浮泡沫。冷藏4 d后，魚肉表面產(chǎn)生黏液，手觸黏稠，顏色稍微暗淡，手指輕壓后回復速度慢；水煮后湯汁漂浮少量碎肉，肉鮮味平淡，肌肉組織缺乏彈性造成口感明顯下降。到第6天感官評定時魚肉已有不愉快異味，表面大量黏液，腥臭味明顯；水煮后湯汁混濁，此時魚肉已輕微腐敗。

3 結 論

新鮮草魚肉含有較高含量的鮮味化合物IMP，但在冷藏過程中蓄積時間很短。冷藏后ATP含量快速下降但ADP、AMP保持穩(wěn)定未出現(xiàn)積累現(xiàn)象。ATP關聯(lián)物最終以Hx為主要蓄積物，說明草魚為Hx生成型魚種。冷藏后草魚TVB-N含量一直上升，結合ATP關聯(lián)物變化趨勢和感官評定結果，高含量的IMP與肉質鮮美密切相關，而Hx含量的蓄積則說明魚肉細菌腐敗的程度。冷藏2 d的草魚處于一級品范圍，TVB-N＜13 mg/100 g，6 d后肉質已腐敗，TVB-N＞30 mg/100 g[25]。低溫冷藏雖然能有效抑制細菌繁殖，延緩魚肉的腐敗，但不能很好地保持魚肉的鮮味和口感。因此研究草魚冷藏期間ATP關聯(lián)物含量的變化，探究其風味物質變化的機理，進一步分析如何保持魚肉在貯藏過程中風味物質的穩(wěn)定具有重要意義。

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