彭芳剛，吳衛(wèi)國，李綺麗，賓冬梅，陳曉華

（1.衡陽師范學院生命科學系，湖南 衡陽 421008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128）

原花青素（proanthocyanidins，PC），是一類黃烷類單體及其聚合體的多酚類化合物，具有多種生物藥理活性，如清除自由基[1]、抗氧化性[2]、防癌抗癌[3]、抗疲勞[4]等，且安全無毒性[5]，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。植物體內(nèi)的原花青素是一種多分散體系，聚合度從幾到幾十，不僅聚合度組成復(fù)雜，而且各組分間性質(zhì)相近，因此除單體原花青素和部分低聚原花青素之外，很難分離純化得到單一結(jié)構(gòu)的純多聚原花青素，只能得到一定分子質(zhì)量范圍的多聚原花青素混合物[6]。因此，一般只能以原花青素混合物為對象，結(jié)合化學反應(yīng)和現(xiàn)代儀器研究化學組成和結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)紅外光譜圖中吸收峰譜帶的位置、形狀和強度，結(jié)合分子特征基團振動頻率和結(jié)構(gòu)的關(guān)系，可以確定分子中所含的基團或化學鍵，并辨別原花青素的兩種單元結(jié)構(gòu)——原花青定和原翠雀定[7-8]。反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）及反相高效液相色譜-電噴霧電離-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用（RP-HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry，RP-HPLC-ESI-MS），可以較好地分離原花青素單體及低聚體的某些異構(gòu)體，能夠確定原花青素的單體和低聚原花青素組分[9-10]。

本實驗對按聚合度分級分離得到的4 種紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨丶壏郑冗M行平均聚合度測定，得出各級分的平均聚合度差異，再進行紅外光譜掃描，根據(jù)各級分的紅外光譜圖，推斷紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐闹饕Y(jié)構(gòu)單元，再進行RP-HPLC分析及RP-HPLC-ESI-MS分析，揭示不同級分的組成和化學結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅蓮?fù)馄し?湖南粒粒珍湘蓮食品有限公司；大孔吸附樹脂AB-8 天津市海光化工有限公司；兒茶素等標準品 美國Sigma公司；乙腈和乙酸（色譜純）、丙酮等其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

大孔樹脂層析柱（d15 mm×300 mm） 鹽城泓宇玻璃儀器廠；SKY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海滬粵明科學儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；FD-1B冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Nicolent 6700傅里葉紅外光譜賽默飛世爾科技公司；1290 infinity LC/6530 Q-TOF MS液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)、1100液相分析色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨匕淳酆隙确旨壏蛛x

結(jié)合溶劑萃取法、柱層析法和溶劑沉淀法對紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨匕淳酆隙冗M行分級分離，分級分離流程如下。

1.3.2 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨馗骷壏值木酆隙确治?/p>

1.3.2.1 實際聚合度的測定[11]

純原花青素的聚合度（degree of polymerization，DP）可以用相同質(zhì)量的單體和聚合體產(chǎn)物吸光度的比值確定。

式中：A1、m1分別為單體兒茶素乙酸溶液與香草醛溶液反應(yīng)后產(chǎn)生的吸光度和質(zhì)量/g；A2、m2分別為聚合原花青素乙酸溶液反應(yīng)后產(chǎn)生的吸光度和質(zhì)量/g。

不純的原花青素的DP計算如式（2）所示：

式中：m為原花青素質(zhì)量/g；n為原花青素物質(zhì)的量/mol；M為單體兒茶素的分子質(zhì)量。

1.3.2.2 原花青素質(zhì)量的測定

采用香草醛-鹽酸法[12]。實驗組：依次取0.5 mL提取液，3 mL質(zhì)量分數(shù)4%香草醛-甲醇溶液以及1.5 mL濃鹽酸加入試管中，充分混勻后于30 ℃水浴20 min后在波長500 nm處測定吸光度A1。對照組：依次取0.5 mL提取物溶液，3 mL甲醇以及1.5 mL濃鹽酸加入試管中，充分混勻后于30 ℃水浴20 min后在500 nm波長處測定吸光度A0?？瞻捉M：蒸餾水。

原花青素的吸光度：

式中：A1平為3 次測定A1的平均值；A0平為3 次測定A0的平均值。

以兒茶素為標準品，以吸光度為縱坐標，兒茶素質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，擬合得到標準曲線方程為：y=1.347 6x+0.016 6，R2=0.999 6。線性范圍為0.025～1 mg/mL。依據(jù)此方程計算樣液中原花青素質(zhì)量濃度。

1.3.2.3 原花青素物質(zhì)的量的測定[11]

取1 mL樣品乙酸溶液與5 mL含4%鹽酸和0.5%香草醛的乙酸溶液混合均勻，于20 ℃條件下反應(yīng)5 min后在波長500 nm處測定吸光度。以乙酸代替樣品溶液作空白對照。

以兒茶素為標準品，以吸光度為縱坐標，原花青素物質(zhì)的量濃度（μmol/mL）為橫坐標，擬合得到的標準曲線方程為：Y=5.646X+0.034 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，線性濃度范圍為0.05～0.25 μmol/mL。根據(jù)此方程計算樣液中原花青素的物質(zhì)的量濃度。

1.3.3 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐募t外光譜分析

將紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨馗骷壏衷嚇优c溴化鉀按2%比例混合研磨壓片，在紅外光譜儀中先對純溴化鉀薄片進行背景掃描，然后再對含有樣品的溴化鉀薄片進行掃描，掃描頻率為32次/s，掃描波數(shù)為4 000～400 cm－1。

1.3.4 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐姆聪喔咝б合嗌V分析及質(zhì)譜聯(lián)用分析

MS條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm）；流動相：A為0.25%乙酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫如下：0～20 min，2%～20% B；20～50 min，20%～35% B；50～60 min，35% B；60～65 min，35%～2% B；65～70 min，2% B。流速0.8 mL/min；柱溫15 ℃；280 nm雙通道紫外-可見檢測器檢測。

ESI-MS條件：負離子掃描方式；碎片電壓135 V；毛細管電壓2 500 V；霧化壓力30 psi；干燥氣體溫度350 ℃；質(zhì)譜離子范圍50～1 500 D。

1.3.5 純度計算公式

2 結(jié)果與分析

2.1 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨馗骷壏值挠^察分析

圖1 冷凍干燥得到的原花青素的各級分Fig.1 Freeze dried proanthocyanidin fractions

紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨匕淳酆隙确旨壏蛛x后，冷凍干燥得到級分F1、F2、F3、F4，如圖1所示。色澤上，F(xiàn)1呈淡黃色，F(xiàn)2、F3、F4顏色由淡紅色到暗紅色逐漸加深；狀態(tài)上，F(xiàn)1一直保持粉末狀態(tài)，F(xiàn)2、F3、F4在室溫條件下放置過久會黏成一團，其中F4最容易成團，推測其原因可能是原花青素的酚羥基易與水形成羥基，所以原花青素溶液不易干燥，干燥后樣品也容易吸潮[13]，而且原花青素聚合度越大，越容易與水形成羥基，越容易吸潮。同時，F(xiàn)1、F2、F3、F4純度經(jīng)測定分別為91.86%、69.4%、55.2%、38.9%，原花青素與多糖的結(jié)合也會導致其容易吸潮。

2.2 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨馗骷壏值木酆隙确治?/h3>

以原花青素級分F1、F2、F3、F4為樣品，分別測定平均聚合度，結(jié)果見表1。

表1 原花青素各級分的聚合度Table 1 Degrees of polymerization of proanthocyanidin fractions

由表1可知，原花青素級分F1、F2、F3、F4的平均聚合度依次增大，說明通過乙酸乙酯萃取分離得到的乙酸乙酯級分（F1）為低聚原花青素，水溶性級分（F2、F3、F4）為高聚原花青素[14]；采用氯仿-甲醇二相體系沉淀分離原花青素水溶性級分，依次得到級分F4、F3、F2，聚合度依次減小[15]。由此可見，采用乙酸乙酯萃取分離和氯仿-甲醇二相體系沉淀分離，使紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨匕淳酆隙却笮》旨壏蛛x效果明顯。

2.3 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐募t外光譜分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀對F1、F2、F3、F44 種級分進行紅外光譜分析，得到紅外光譜圖如圖2所示。

圖2 原花青素級分F1的紅外光譜圖Fig.2 IR Spectrum of proanthocyanidin fraction F1

由圖2可見，3 425 cm－1處的強吸收峰，是原花青素分子中羥基的伸縮振動，2 923 cm－1處苯環(huán)的C—H伸縮振動，1 619、1 517、1 449 cm－1處是苯環(huán)骨架C＝C的特征伸縮振動峰，1 282、1 201 cm－1處是酚羥基伸縮振動及面內(nèi)彎曲振動，1 146 cm－1處是C環(huán)中的C—H伸縮振動，1 103、1 064 cm－1處是原花青素分子中C—C的伸縮振動，818 cm－1處的吸收峰可能是由于苯環(huán)上有3 個相鄰的H存在產(chǎn)生的，771 cm－1處芳香環(huán)的不飽和C—H面外變形振動。

圖3 原花青素級分F2、F3、F4的紅外光譜圖Fig.3 IR Spectra of proanthocyanidin fractions F2, F3 and F4

原花青素B環(huán)羥基的數(shù)量變化對原花青素的紅外光譜有直接影響，可根據(jù)紅外吸收特征粗略估計原花青定（B環(huán)含有2 個羥基）和原翠雀定（B環(huán)含3 個羥基）在多聚原花青素中的比例[16]。由圖2可見，F(xiàn)1在強振動頻率區(qū)1 540～1 510 cm－1處只有1 517 cm－1一個峰，表明F1是以原花青定為主要結(jié)構(gòu)單元的原花青素或原翠雀定結(jié)構(gòu)單元的比例少于60%。F1在低頻指紋區(qū)780～730 cm－1處只有771 cm－1一個峰，在730 cm－1處無吸收峰，表明F1是以原花青定為主要結(jié)構(gòu)單元的原花青素。由此可以推斷出，F(xiàn)1是以原花青定為主要結(jié)構(gòu)單元的原花青素。

比較圖2和圖3發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2、F3、F4的紅外光譜圖與F1的紅外光譜圖吸收峰譜帶形狀相似，但位置和強度不同，可能是含有的雜質(zhì)使紅外光譜圖吸收峰偏移，即強而寬的羥基伸縮振動峰（3 400 cm－1附近），苯環(huán)的C—H伸縮振動峰（2 920 cm－1附近），苯環(huán)峰（1 630 cm－1附近），C環(huán)中的C—H伸縮振動峰（1 130 cm－1附近），原花青素分子中C—C的伸縮振動峰（1 060 cm－1附近）。F1、F2、F3、F4在2 920 cm－1和1 150 cm－1附近均有吸收峰，但F1的最尖銳，其次為F2，根據(jù)Foo[17]的研究，原花青素聚合度越大，在2 920 cm－1和1 150 cm－1附近的吸收峰越不明顯，可推斷F1聚合度最低，F(xiàn)2聚合度居中，F(xiàn)3、F4聚合度較高，與各級分平均聚合度的測定結(jié)果相符。

綜合上述可知，F(xiàn)1、F2、F3、F4原花青素特征骨架振動主要集中在3 500～3 000、1 700～1 000、850～600 cm－1，且紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨厥且栽ㄇ喽橹饕Y(jié)構(gòu)單元。

2.4 紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐腞P-HPLC-ESI-MS分析

2.4.1 原花青素級分F1的RP-HPLC-ESI-MS分析

圖4 原花青素級分F1的高效液相色譜圖（Agilent 1290）Fig.4 HPLC chromatogram (Agilent 1290) of proanthocyanidin fraction F1

圖5 原花青素級分F1的負總離子流色譜圖Fig.5 Total negative ion chromatogram of proanthocyanidin fraction F1

表2 原花青素級分F1的組成分析Table 2 Composition analysis of proanthocyanidin fraction F1

對原花青素級分F1進行RP-HPLC-ESI-MS分析，得到高效液相色譜圖（圖4）和負總離子流色譜圖（圖5），組成分析見表2。通過與標準品共進樣，表明a（10.212 min）為棓兒茶素、e（13.976 min）為兒茶素、h（24.773 min）為表兒茶素。通過計算峰面積可知，單體中兒茶素的含量最高。推斷b、c、d、g四者為由兒茶素或表兒茶素聚合而成的原花青素二聚體，構(gòu)型未知；推斷f、i也是由兒茶素或表兒茶素聚合而成的原花青素四聚體[18]，構(gòu)型未知。因此，F(xiàn)1的主要結(jié)構(gòu)單元為由兒茶素或表兒茶素聚合的原花青定，與Ling Zhiqun等[19]對蓮蓬原花青素的分析結(jié)果相同。這些數(shù)據(jù)也說明，原花青素在反相液相色譜中的出峰時間與聚合度沒有必然關(guān)聯(lián)[20]，各單體出峰時間先后為棓表兒茶素、兒茶素、表兒茶素。

2.4.2 原花青素級分F2、F3、F4的RP-HPLC分析

采用RP-HPLC-ESI-MS分析原花青素時只能分離單體和低聚體，而更高聚合度（≥5）的原花青素，由于分子質(zhì)量大，可能無法質(zhì)子化，故原花青素級分F2、F3、F4不能用 ESI-MS定性分析。因此，以F1的RP-HPLC-ESIMS得出的組成分析結(jié)果為模板，來確定原花青素級分F2、F3、F4的組成。然而對F1進行RP-HPLC-ESI-MS分析時，使用的液相分析儀為Agilent 1290，而對其單獨進行液相掃描時，使用的液相分析儀是Agilent 1100，兩種型號的液相分析儀在同條件下掃描得出色譜圖存在差異。所以使用Agilent 1100進行RP-HPLC分析時，先用單體標樣確定單體的保留時間，然后根據(jù)F1的高效液相色譜圖（Agilent 1290）各組分的出峰順序及峰形，確定其他組分在F1的高效液相色譜圖（Agilent 1100）中的保留時間，從而推測出這些組分是否存在于F2、F3、F4中。

標樣兒茶素和表兒茶素的高效液相色譜圖（Agilent 1100）見圖6，其中兒茶素的保留時間為20.472 min，表兒茶素的出峰時間為23.595 min，與原花青素級分F1的RP-HPLC-ESI-MS分析得到的高效液相色譜圖（Agilent 1290）和負總離子流色譜圖進行比較，將上述兩個峰標記為e、h，并標記組分e、h在F1的高效液相色譜圖（Agilent 1100），和F2、F3、F4的高效液相色譜圖（Agilent 1100）中的位置。

圖6 標樣兒茶素和表兒茶素的高效液相色譜圖（Agilent 1100）Fig.6 HPLC chromatogram (Agilent 1100) of mixed standards of catechin and epicatechin

圖7 原花青素級分F1（A）、F2（B）、F3（C）、F4（D）的高效液相色譜圖（Agilent 1100）Fig.7 HPLC chromatograms (Agilent 1100) of proanthocyanidin fractions F1, F2, F3 and F4

通過比較F1的高效液相色譜圖（Agilent 1290）和高效液相色譜圖（Agilent 1100）中各組分的出峰順序及峰形，標記組分b（16.690 min）、c（18.142 min）、d（19.504 min）、f（21.892 min）、g（23.005 min）在F1的高效液相色譜圖（Agilent 1100）中的位置（四聚體i峰形無顯著性特征，且距其他已鑒定的組分距離較遠，無法確定位置），見圖7A。再根據(jù)各組分在圖7中的保留時間，標記組分b、c、d、f在F2、F3、F4的高效液相色譜圖（Agilent 1100）中的對應(yīng)位置，見圖7B、C、D。可能由于F1中棓兒茶素的含量很低，容易損失，或受到雜質(zhì)和儀器的影響，未能在上述液相色譜圖中找到a（棓兒茶素）對應(yīng)的峰。同時也由于F2、F3、F4含有大量高聚體，各聚合體在高效液相色譜中發(fā)生重疊，形成一個大峰而無法分離，干擾了低聚體組分的出峰，所以不能確定F2、F3、F4中是否存在組分f、g、i。但在F2、F3、F4的高效液相色譜圖（Agilent 1100）中出現(xiàn)含量較多的新組分j（16.108 min），未能確定是何種化合物。

對圖7進行整體比較分析，發(fā)現(xiàn)原花青素乙酸乙酯級分（F1）和原花青素水溶性級分（F2、F3、F4）峰形差別很大，已檢測出的組分在F1、F2、F3、F4中的百分含量也存在很大差異。F2、F3、F4的液相色譜圖在25 min前的峰形非常相似，25 min以后從F2、F3到F4峰形越來越寬，推測是含有的高聚體組分越來越多，需要更高體積分數(shù)的乙腈才能洗脫，故同梯度洗脫條件下，峰跑平時間延長。

3 結(jié) 論

采用乙酸乙酯萃取分離法和氯仿-甲醇二相體系沉淀分離法，使紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨匕淳酆隙却笮》旨壏蛛x依次得到F1、F2、F3、F4，其平均聚合度依次為2.12、7.27、7.85、8.16。紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨氐? 種級分的紅外光譜圖均表現(xiàn)出明顯的原花青素特征骨架振動，且可推測出紅蓮?fù)馄ぴㄇ嗨厥且栽ㄇ喽橹饕Y(jié)構(gòu)單元的多聚原花青素。原花青素級分F1的RP-HPLC-ESI-MS分析檢測出3種單體、4種二聚體和2 種四聚體，3 種單體分別為棓兒茶素、兒茶素、表兒茶素，4 種二聚體和2 種四聚體都是由兒茶素或表兒茶素單體聚合而成，其中兒茶素和2 種二聚體的含量最多。水溶性級分F2、F3、F4的高效液相色譜圖與原花青素乙酸乙酯級分F1峰形差別很大，已檢測出的組分在F1、F2、F3、F4中的百分含量也存在很大差異。水溶性級分F2、F3、F4均含有3 種二聚體，其中1 種二聚體含量較多，同時F2、F3、F4中還存在一種含量較多的未知組分。

[1]LUXIMON RAMMA A, BAHORUN T, SOOBRATTEE M A, et al.Antioxidant activities of phenolic, proanthocyanidin, and flavonoid components in extracts of cassia fistula[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(18): 5024-5047.

[2]BAGCHI D, BACHI M, STOHS S J, et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention[J].Toxicology, 2000, 148(2): 187-197.

[3]ENGELBRECHT A M, MATHEYSE M, ELLIS B, et al.Proanthocyanidin from grape seeds inactivates the PI3-kinase/PKB pathway and induces apoptosis in a colon cancer cell line[J].Cancer Letters, 2007, 258(1): 144-153.

[4]邢雁霞, 劉斌鈺, 邵鴻娥, 等.原花青素對小鼠耐力和抗氧化酶活性的實驗研究[J].中國自然醫(yī)學雜志, 2010(6): 415-416.

[5]YAMAKOSHI J, SATIO M, KATAOKA S, et al.Safety evaluation of proanthocyanidin rich extract from grape seeds[J].Food and Chemical Toxicology, 2002, 40(5): 599-607.

[6]石碧, 狄瑩.植物多酚[M].北京: 科學出版社, 2000: 38-39.

[7]李春陽, 張紅城, 王乃富, 等.葡萄籽原花青素的單元結(jié)構(gòu)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報, 2010, 26(5): 1070-1077.

[8]WU Yanwen, SUN Qin, ZHOU Qun, et al.Fourier transform midinfrared (MIR) and near-infrared (NIR) spectroscopy for rapid quality assessment of chinese medicine preparation honghua oil[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008, 46(3): 498-504.

[9]肖俊松, 曹雁平, 龔玉石, 等.青蛇果原花青素分離和低聚體純品的制備[J].食品科學, 2009, 30(17): 113-119.

[10]PRASAIN J K, PENG N, DAI Y, et al.Liquid chromatography tandem mass spectrometry identification of proanthocyanidins in rat plasma after oral administration of grape seed extract[J].Phytomedicine, 2009,16(2/3): 233-243.

[11]魏冠紅, 魏作軍, 蘇寶根, 等.測定原花青素平均聚合度的一種新方法[J].中國食品學報, 2006, 6(6): 112-116.

[12]李綺麗, 吳衛(wèi)國, 彭芳剛, 等.蓮子皮原花青素測定方法的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(2): 241-245.

[13]魏慶元.皮革鞣質(zhì)化學[M].北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1978: 376.

[14]杜曉.落葉松原花青素的分級及精細化利用研究[D].成都: 四川大學, 2006.

[15]孫蕓, 孫寶才, 谷文英, 等.葡萄籽原花青素聚合度與自由基清除能力關(guān)系的研究[J].食品科學, 2007, 28(12): 423-428.

[16]孫達旺.植物單寧化學[M].北京: 中國林業(yè)出版社, 1992: 201-202.

[17]FOO L Y.Proanthocyanidins: gross chemical structures by infrared spectra[J].Phytochemisty, 1981, 20(6): 2278-2286.

[18]FRIEDRICH W, EBERHARDT A, GALENSA R.Investigation of proanthocyanidins by hplc with electrospray ionization mass spectrometry[J].European Food Research and Technology, 2000,211(1): 56-64.

[19]LING Zhiqun, XIE Bijun, YANG Erling.Isolation, characterization,and determination of antioxidative activity of oligomeric procyanidins from the seedpod of nelumbo nuciferagaertn[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(7): 2441-2445.

[20]任其龍, 魏冠紅, 金米聰, 等.反相高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法鑒定葡萄籽低聚原花青素[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(3): 79-82.