王明樂，房婉萍，黎星輝

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095）

在我國山茶科山茶屬植物（茶葉、山茶、油茶、茶梅）的種子習(xí)慣上統(tǒng)稱為“茶籽”[1-2]。茶籽中含有脂肪、蛋白質(zhì)、多糖、皂素、咖啡堿、茶多酚、粗纖維和無機(jī)元素等多種有效成分，其中茶籽多糖（tea seed polysaccharides，TSPS）含量較高，達(dá)20%左右[3]。研究表明，植物多糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗感染、治療艾滋病等多種生物活性[4-8]；多糖糖鏈在控制細(xì)胞分裂、分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和衰老等方面也起著決定性的作用[9]。

現(xiàn)今，茶多糖（tea polysaccharide，TPS）作為一種幾乎無毒副作用的天然提取物已經(jīng)引起了相關(guān)研究者的重視；國內(nèi)外對茶葉多糖（tea leaves polysaccharide，TLPS）的理化性質(zhì)、分離純化方法和生理活性的研究報道較為全面，而對茶籽多糖研究的綜合性報道則少之又少[10-16]。本文對近年來茶籽多糖的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用茶籽多糖提供參考。

1 茶籽多糖的提純

1.1 茶籽多糖的提取方法

多糖的提取方法有水提法[17-19]、酸堿提取法[20]、有機(jī)溶劑提取法[21]、超臨界CO2法[22]、酶法[23-24]、超聲波輔助提取法[25-26]和微波輔助提取法[27-28]。已有的研究[29]表明，多糖熱穩(wěn)定差，高溫、過酸或偏堿的條件均會使其部分降解。因此，多糖的提取應(yīng)避免在高溫和強(qiáng)酸強(qiáng)堿中進(jìn)行，否則極易使多糖中的糖苷鍵斷裂而發(fā)生構(gòu)象變化，甚至失去生物活性。

各提取法中，由于酸提法和堿提法對實驗條件要求較高，加之操作不便，因此這兩種方法并不經(jīng)常使用。而采用乙醇沉淀，不但選擇性好、滲透性強(qiáng)、浸出率高，而且安全環(huán)保，現(xiàn)在茶籽多糖的提取中應(yīng)用較多。田洪舟等[30]以茶籽餅粕為原料，研究了料液比、提取溫度和時間對提取的茶籽多糖的含量和純度的影響，經(jīng)單因素試驗和正交試驗得出茶籽多糖的較佳提取條件為料液比1∶12（m/V）、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取溫度55 ℃、提取時間3.0 h，其得率和純度分別達(dá)6.92%和78.74%。胡平平等[31]以油茶餅粕為原料，脫脂后提取茶皂素，并利用乙醇沉淀提取茶籽多糖，經(jīng)正交試驗得出提取茶籽多糖的較佳工藝參數(shù)為：溫度70 ℃、料液比1∶30（m/V）、提取時間4 h，多糖在此條件下的提取率為5.88%。此方法采用先提取茶皂素后提取多糖的綜合提取工藝，排除了提取多糖的后續(xù)處理過程中茶皂素的干擾，在一定程度上簡化了提取工藝。

黃威等[32]以油茶籽浸出粕為原料，采用甲醇浸提法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗發(fā)現(xiàn)：料液比為1∶10（m/V）、甲醇體積分?jǐn)?shù)為85%、提取溫度65 ℃、浸提時間3 h為較佳的工藝參數(shù)；此條件下茶籽多糖的提取率達(dá)到3.84%，純度為89.7%。雖然使用甲醇提取所得茶籽多糖純度較高，但由于甲醇的毒性較強(qiáng)，一般不建議采用。

杜立春等[33]采用低沸點(diǎn)醇（無水乙醇或無水甲醇或甲醇和乙醇的混合物）為溶劑回流提取已脫脂油茶餅粕中的茶皂素和茶多糖，回收溶劑得浸膏，然后使用無水正丁醇提取浸膏中的茶籽多糖，最終分離得到純度大于95%的白色茶多糖，顯著高于一般茶多糖提取方法。該方法工藝簡單、環(huán)保，生產(chǎn)與設(shè)備成本低，易于大工業(yè)生產(chǎn)。

隨著我國科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新裝備也開始應(yīng)用到茶籽多糖的提取中。微波輔助提取具有高效性、高頻性、選擇性和波動性等特點(diǎn)，該法副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高，提取時間短。微波的熱效應(yīng)可以穿透到介質(zhì)內(nèi)部，迅速破壞細(xì)胞壁，使提取物快速分離出來[34]。張忠等[35]以茶籽為原料，采用微波輔助提取法發(fā)現(xiàn)：浸提功率400 W、固液比1∶30（m/V）、pH 5.0、浸提時間30 s為較合適的提取條件。王瑾等[36]也采用此方法，以冷榨油茶籽餅為原料，與水提取法進(jìn)行比較，得出料液比1∶5（m/V）、微波功率600 W、提取時間9 min、pH 6.0為較佳的提取條件；然后采用6%的三氯乙酸法脫除蛋白質(zhì)，30%的雙氧水脫色，最終經(jīng)醇沉、濃縮干燥后得到淡黃色多糖晶體。經(jīng)比較，該方法與傳統(tǒng)熱水浸提方法相比能極大的提高茶籽多糖的得率。

基于超聲波技術(shù)發(fā)展起來的超聲波輔助提取法是近年來經(jīng)常采用的樣品前處理方法，空化效應(yīng)是其主要動力，有助于加速待測物中有效成分進(jìn)入溶劑，縮短體系達(dá)到平衡的時間[37]。張忠[38]、譚搏[39]等分別以茶籽和茶籽餅粕為原料，經(jīng)超聲波輔助提取茶籽多糖時發(fā)現(xiàn)，在試驗條件范圍內(nèi)，對茶籽多糖浸出率的影響順序為固液比＞溫度＞功率＞時間，固液比1∶40（m/V）、溫度60 ℃、浸提功率400 W、浸提時間5 min為較佳的工藝參數(shù)。

以超臨界CO2作為溶劑，無毒、無害，不會造成被萃取物的污染，解決了有機(jī)溶劑萃取方法中溶劑殘留等問題，工藝簡單，只需控制溫度、壓力等主要參數(shù)即可達(dá)到提取混合物中不同組分的目的；CO2價廉易得，萃取溶劑可以循環(huán)使用，生產(chǎn)成本較低[40-41]。李博等[42]以茶籽餅粕為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2提取茶籽多糖工藝，運(yùn)用小星點(diǎn)設(shè)計考察萃取時間（30～150 min）、壓力（15～45 MPa）、溫度（40～80 ℃）及夾帶劑乙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)（50%～90%）四因素對茶籽多糖得率的影響，簡化模型后在各因素設(shè)定范圍內(nèi)得到較佳提取條件：萃取時間150 min、壓力45 MPa、溫度60 ℃、夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。該條件下萃取后多糖實際得率為13.23%，較傳統(tǒng)的超臨界CO2萃取法有一定的優(yōu)越性。有人認(rèn)為，食品工業(yè)中使用超臨界流體萃取技術(shù)是最有前途的領(lǐng)域之一。

1.2 茶籽多糖純化

經(jīng)過上述方法提取得到的茶籽粗多糖往往混雜著蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)，必須經(jīng)過進(jìn)一步的分離純化才能得到純度較高的茶籽多糖。茶籽多糖的分離純化步驟，如圖1所示。

圖1 茶籽多糖的純化步驟Fig.1 Flowchart for the purification of TSPS

1.2.1 脫蛋白

常用的粗多糖脫蛋白方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法。其中，Sevag法是脫蛋白的經(jīng)典方法，利用蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)將其除去。該方法在避免多糖降解上效果較好，但是效率不高，如能加入一些蛋白質(zhì)水解酶，再用Sevag法效果更佳。三氟三氯乙烷與多糖混合后攪拌、離心得上清液，連續(xù)幾次即得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率高，但三氟三氯乙烷沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。三氯醋酸對蛋白質(zhì)的脫除效果較好，但此法反應(yīng)劇烈，會引起某些多糖的降解，得率降低。

傳統(tǒng)的植物多糖提取液脫蛋白方法逐漸呈現(xiàn)出劣勢，近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些新的脫蛋白的方法，如醋酸鉛法[43]、氯化鈉法[44]、蛋白酶法[45]、氯化鈣法[46]、氫氧化鈉法[47]、陰離子交換樹脂法[48]、鹽酸法[49]、徑向流動色譜法[50]和鞣酸法[51]，這為除去多糖中的蛋白質(zhì)提供了更為廣闊的前景。然而，這些新方法也有一定的不足，因此人們更傾向于選擇多方法聯(lián)用以彌補(bǔ)各方法單獨(dú)使用時的不足。孫柘等[52]采用蛋白酶-三氯醋酸-正丁醇聯(lián)用法對粒毛盤菌YM281胞外多糖脫蛋白，并經(jīng)均勻設(shè)計優(yōu)化該方法的脫蛋白條件，得出較佳的工藝參數(shù)為粒毛盤菌YM281多糖溶液20 mL、木瓜蛋白酶溶液11 mL、溫度42.2 ℃、pH 4.0、酶解時間3.5 h；除去變性蛋白后再用三氯醋酸和正丁醇法脫蛋白2次即可；在該條件下，蛋白脫除率達(dá)72.3%，而多糖損失率僅為2.93%。趙鵬等[53]采用酶法結(jié)合Sevag法并與三氯乙酸法、Sevag法和酶法單獨(dú)使用的脫蛋白效果對比發(fā)現(xiàn)，前者最為理想，且較佳的工藝條件為：酶用量2.0%、酶解溫度75 ℃、酶解時間2 h、pH 7.0；結(jié)合3次Sevag法操作。此條件下，蛋白脫除率達(dá)83.72%，多糖保留率80.25%。該法可大大減少Sevag法的使用次數(shù)，蛋白脫除率高且條件溫和，應(yīng)用前景廣闊。

1.2.2 色素的去除

色素按其溶解性的不同可分為：脂溶性色素、水溶性色素和其他色素。脂溶性色素的去除可以經(jīng)石油醚或乙醚回流脫脂去除，在回流脫脂的過程中一些脂溶性色素也會被除去；水溶性色素在用熱水浸提多糖時溶解在水中，在用乙醇沉淀多糖時色素就留在上清液中[54]。以上兩種色素在多糖純化時較易去除，而和多糖結(jié)合的其他色素則較難去除，這也是現(xiàn)階段多糖回收效率低下的主要原因。

常用的脫色方法有柱層析法、活性炭法、過氧化氫法、聚酰胺法和Al2O3法等。由于植物材料、實驗條件等的差異，脫色方法不盡相同。對于植物來源的多糖，所含色素多是負(fù)性離子，用活性炭等脫色效果不如用Al2O3層析柱法；如果多糖的色素結(jié)合，可用H2O2脫色。過氧化氫法和活性炭法由于簡單易行而被廣泛使用。對于茶籽多糖而言，由于其色素含量較低，因此，是否進(jìn)行脫色處理可視需要而定。

1.2.3 低聚糖等小分子雜質(zhì)的去除

用透析法將多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1～3 d?？梢杂藐庩栯x子交換樹脂混合床，但只能除去離子，不能除去非極性小分子雜質(zhì)。目前，使用連續(xù)透析儀是一種較為方便的實驗方法[55]。

此外，超濾技術(shù)是利用膜的篩分性質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為推動力將高分子溶質(zhì)與小分子溶質(zhì)依據(jù)其相對分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離。因其操作條件溫和、分離環(huán)境密閉、生產(chǎn)效率高、實用性強(qiáng)而在果汁、發(fā)酵工程、釀造和茶飲料等食品工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[56]。

1.2.4 應(yīng)用實例

陶俊等[57]采用Sevag法對油茶籽多糖粗提物進(jìn)行脫蛋白，然后采用適合于各種酸性、中性多糖和黏多糖的DEAE-纖維素層析來除去油茶籽多糖中的雜質(zhì)，最后經(jīng)SephadexG-100柱層析、透析、濃縮和冷凍干燥得油茶籽多糖精品。由于多糖類物質(zhì)在強(qiáng)堿條件下會發(fā)生異構(gòu)化和分解反應(yīng)，因此只能選用弱堿性或極陰性的離子交換劑來吸附茶籽多糖。郭艷紅[58]在實驗中采用離子交換纖維素DEAE-52對茶籽多糖進(jìn)行分離純化；然后又使用凝膠色譜進(jìn)一步純化得到單一多糖。

王瑾[59]對比了Sevag法和三氯乙酸法脫蛋白效果并從蛋白殘留量和糖得率兩方面判定三氯乙酸法脫除效果較好。而Sevag法雖是經(jīng)典的脫蛋白方法，但操作過程復(fù)雜且樣品損失較大，消耗能量較多。此外，該實驗還對比了活性炭脫色和過氧化氫脫色，雖然活性炭脫色簡便易行，是大部分多糖脫色的首選方法；但是實驗發(fā)現(xiàn)油茶籽多糖可能為糖蛋白，由于活性炭對多糖的物理吸附作用，會造成多糖的部分損失，導(dǎo)致脫色效果不理想，因而選擇過氧化氫法脫色。由于過氧化氫是一種氧化脫色劑，能將多糖提取液脫至無色，但色素物質(zhì)還是會殘留在溶液中，而過量的過氧化氫需要充分的透析除去，否則會對后續(xù)的凝膠柱層析中的凝膠造成損害。

2 茶籽多糖的理化性質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn)，茶籽多糖是黏度適中、非淀粉、非酚類物質(zhì)、不含還原糖和氨基酸的淡黃色粉狀晶體；茶籽多糖溶于熱水，不易溶解于冷水，不溶于高體積分?jǐn)?shù)的乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇等有機(jī)溶劑；對雙縮脲試劑和茚三酮溶液均無顏色反應(yīng)而遇蒽酮-硫酸試劑或其他糖的顯色劑（如苯酚-硫酸）都能發(fā)生相應(yīng)的特征顏色反應(yīng)；熱穩(wěn)定性較差，高溫易降解[57,59]。

3 茶籽多糖的結(jié)構(gòu)分析

多糖的結(jié)構(gòu)可分為一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)。多糖的一級結(jié)構(gòu)可簡要描述為單糖的連接方式，既包括單糖的組成又包括各單糖間的連接方式。多糖經(jīng)分離純化并驗證后即可進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)的分析。多糖的一級結(jié)構(gòu)分析方法很多，主要分為三類：化學(xué)分析法、物理分析法和生物分析法。目前，化學(xué)法在研究中的應(yīng)用比較成熟，如水解法（包括完全水解法和部分酸水解法）、過碘酸氧化和Smith降解、甲基化反應(yīng)、順序降解法等；物理方法主要借助紙色譜、高效凝膠色譜、紅外光譜法、核磁共振波譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法等各種分析儀器來完成；生物法主要是利用特異性糖苷酶的酶法分析，利用酶的專一性強(qiáng)的特點(diǎn)用不同酶和放射性標(biāo)記的方法來分析糖鏈結(jié)構(gòu)和糖苷鍵的類型[60]。由于茶籽多糖是極其復(fù)雜的化合物，因此，在實際應(yīng)用中通常是物理、化學(xué)多方法結(jié)合使用。近些年的研究雖已對茶籽多糖的一級結(jié)構(gòu)有所認(rèn)識，但其精確的內(nèi)部構(gòu)造還不是很清楚，這主要是因為其一級結(jié)構(gòu)本身非常復(fù)雜，再加上糖殘基上可以連接硫酸基團(tuán)、乙酯基團(tuán)、磷酸基團(tuán)和甲基化基團(tuán)，這更加劇了多糖一級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性[57]。

表1 茶籽多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Table 1 Structure features of TSPS

多糖的高級結(jié)構(gòu)是指在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，各側(cè)鏈通過非共價鍵相互結(jié)合作用而形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。常用的多糖高級結(jié)構(gòu)測定方法有：核磁共振、X射線衍射法、圓二色譜法、原子力顯微鏡法、電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡。

統(tǒng)觀近年茶籽多糖方面的研究，主要集中在提取、純化、一級結(jié)構(gòu)分析和生物活性方面，而對其高級結(jié)構(gòu)的研究較少。除了由于茶籽多糖本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性外，方法不完善也阻礙了對其高級結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探索?，F(xiàn)已從茶籽中陸續(xù)分離得到多種多糖，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)見表1。

4 茶籽多糖的生物活性

大量藥理和臨床實驗證明，從天然產(chǎn)物中分離出的多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識別、細(xì)胞間物質(zhì)的傳輸、癌癥的診斷與治療等都有密切關(guān)系[61-63]。對于茶籽多糖而言，經(jīng)過實驗得到證實的功能則少之又少，且主要集中在促進(jìn)生長和抗氧化兩方面，這也為其他功能的發(fā)掘提供了廣闊的空間。

4.1 促進(jìn)生長的作用

王瑾[59]和袁鐘宇[64]等的實驗結(jié)果表明，茶籽多糖能夠促進(jìn)肉雞生長，并推測其對肉雞生產(chǎn)性能的影響可能與多糖促進(jìn)RNA、DNA和蛋白質(zhì)的合成，清除自由基，激活免疫系統(tǒng)活性的特征有關(guān)。李學(xué)軍等[65]在生長豬日糧中添加茶籽多糖除也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果：豬的生長性能得到改善。

4.2 抗氧化性

張忠等[38]研究發(fā)現(xiàn)，提取方法對茶籽多糖的抗氧化性也有影響；超聲波輔助提取對茶籽多糖清除·OH的能力影響不顯著，而對茶籽多糖清除O2－·的能力有較好的增強(qiáng)作用，其原因是超聲波輔助提取茶籽多糖能夠縮短浸提時間，避免了茶籽多糖在水中長時間受熱，從而使得茶籽多糖清除O2－·的能力增強(qiáng)。李學(xué)軍等[65]的研究還發(fā)現(xiàn)，茶籽多糖能通過提高生長豬體內(nèi)抗氧化酶的活力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而增強(qiáng)生長豬機(jī)體的抗氧化能力。

胡平平[31]使用了4種不同的體外抗氧化體系（DPPH自由基體系、·體系、·OH體系和還原力測定）對油茶餅粕多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)油茶餅粕多糖具有較好的清除DPPH自由基、、·OH和一定的還原力，其IC50分別為9.449、0.989、3.5 mg/mL。然而，四體系中油茶餅粕多糖的抗氧化能力均低于等質(zhì)量濃度的VC。此外，黃威[66]和Wang Yunfeng[10]等也證明了茶籽多糖具有一定的抗氧化活性。

4.3 其他功能

Wei Xinlin等[67]通過體外培養(yǎng)K562人類白血病細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，在0.5～400 μg/mL范圍內(nèi)茶籽多糖能夠顯著抑制K562人類白血病細(xì)胞的生長，50 μg/mL時其抑制率最高，達(dá)（38.43±2.22）%；免疫活性研究表明：茶籽多糖能有效促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。這表明茶籽多糖可作為天然的抗癌藥物。

5 結(jié) 語

目前，茶籽多糖的結(jié)構(gòu)研究還處在研究其一級結(jié)構(gòu)中單糖的組成階段。就多糖一級結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系而言，一方面多糖的組成和糖苷鍵類型對其生物活性有一定影響，另一方面是多糖中的一些官能團(tuán)（如硫酸酯化多糖）對活性的影響。茶籽多糖的高級結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系至今尚不十分清楚，但同蛋白質(zhì)和核酸一樣，立體構(gòu)型是決定多糖生物活性的決定因素之一；同時，多糖的分子質(zhì)量、取代基、溶解度、黏度甚至給藥劑量、途徑等也都影響其生物活性。茶籽原料、提取方法的不同，提取的茶籽多糖組成成分并不完全形同，其功能也會有所差異。

其次，研究者對于茶籽多糖生理活性上的研究很少，且主要集中在促進(jìn)生長和抗氧化活性方面，而對其他生理活性探索較少；然而，茶籽多糖和茶葉多糖具有類似的結(jié)構(gòu)特征，其潛在的生理活性價值有助于為茶籽資源的開發(fā)利用提供新的途徑。研究茶籽多糖的體內(nèi)抗氧化實驗以及抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等方面的生物活性實驗，探討茶籽多糖的各種活性機(jī)理，研究其構(gòu)效關(guān)系等需要我們進(jìn)一步去完成。

最后，茶籽多糖作為一種功能性食品或飼料添加劑的開發(fā)尚處于起步階段，具有廣闊的市場前景，可大力發(fā)展其作為一類新型的保健食品、藥品原料和功能性食品添加劑。

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