陳俊亮，田 芬，霍貴成，張慧蕓

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.杭州娃哈哈集團有限公司研究院，浙江 杭州 310018）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，α-Gal，EC3.2.1.22）屬外切糖苷酶類，能夠?qū)Ｒ恍源呋沁€原末端α-半乳糖苷鍵的水解[1]，它不僅能夠水解含α-半乳糖苷的半乳甘露低聚糖和棉子糖族低聚糖[2-3]，而且能夠水解含該鍵的多糖[3-5]，此外，它還能作用于含有α-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂質(zhì)[6]，因此α-半乳糖苷酶在食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[7-9]。在食品行業(yè)中，大豆蛋白質(zhì)是氨基酸平衡模式的典范，但是在豆制品中存在α-半乳糖苷寡糖類物質(zhì)，由于人的消化系統(tǒng)中缺乏降解此類物質(zhì)的α-半乳糖苷酶，當(dāng)這些物質(zhì)消化經(jīng)過大腸時，微生物發(fā)酵會產(chǎn)生大量氣體，從而導(dǎo)致腹脹，因此在豆制品中添加α-半乳糖苷酶可以分解這些寡糖，增加人體對豆類營養(yǎng)成分的吸收[10]。

α-半乳糖苷酶主要來源于微生物、植物和動物，其中微生物的產(chǎn)酶量較高，國內(nèi)外學(xué)者已篩選出多種產(chǎn)α-半乳糖苷酶活性的微生物，主要包括短雙歧桿菌、青霉菌、酵母菌、放線菌等[10]。為了能夠滿足食品加工的要求，開發(fā)耐熱性α-半乳糖苷酶，尋找高產(chǎn)酶量的微生物成為研究熱點。實驗以1株產(chǎn)α-半乳糖苷酶長雙歧桿菌KLDS2.0509作為研究對象[11]，從酶的pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、不同金屬離子的影響，以及底物特異性等方面進行研究，為今后開發(fā)α-半乳糖苷酶的乳酸菌發(fā)酵劑的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長雙歧桿菌KLDS2.0509 乳品科學(xué)教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心。

Trypticase peptone-yeast extract（TPY）培養(yǎng)基：酪蛋白胨12 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、多聚蛋白胨（polypepton）3 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母粉5 g/L、低聚果糖5 g/L、吐溫-80 1 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、K2HPO43H2O 0.2 g/mL、檸檬酸氫二氨0.2g/mL、乙酸鈉0.5 g/mL、硫酸鎂58 mg/mL、硫酸錳25 mg/mL，pH6.5；蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、pNPG（p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside）、牛血清白蛋白 美國Sigma公司；酵母粉、蛋白胨 英國Oxiod公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實驗設(shè)備有限公司；DU800核酸/蛋白質(zhì)分析儀 美國Beckman公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；HIRAYAMA HVE-50型高壓滅菌器 日本Hirayama公司；Delta320pH計 瑞士梅特勒-托利多（上海）有限公司；離子交換色譜儀 美國Dionex公司；Simplicity超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1α-半乳糖苷酶的制備

將菌株KLDS2.0509在TPY培養(yǎng)基中連續(xù)兩次增殖，體積分數(shù)5%活化發(fā)酵劑接種于200 mL添加1 g/100 mL葡萄糖和1 g/100 mL棉子糖的TPY肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。在發(fā)酵12、24、36、48 h時分別取樣50 mL，以6 000×g離心10 min收集菌體，用20 mL冷的50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.5，4 ℃）清洗細胞沉淀，接著6 000×g離心10 min，重復(fù)以上清洗操作。然后用10 mL相同的緩沖液懸浮細胞沉淀，放置于冰浴中，超聲波處理（間歇破碎80次，工作時間3 s，間隔4 s），最后12 000×g離心30 min除去細胞碎片，上述所有離心操作都在4 ℃進行，上層清液用作天然酶提取物[12]。

1.3.2 酶活力測定

取250 μL酶液與500 μL 5 mmol/L的pNPG混合，在37 ℃溫育30 min，添加500 μL的0.2 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，在400 nm波長測定其OD值，以p-NP的生成量表示酶活力。分別測定不同濃度對硝基苯酚標準品的OD400nm，根據(jù)測得的吸光度，繪制標準曲線。

酶活力單位（U/mL）定義為：在測定條件下每分鐘每毫升pNPG釋放1 μmol的p-NP所需的酶量[13]。

1.3.3 酶的純化

向粗酶液中加入固體(NH4)2SO4至30%的飽和度，4 ℃鹽析10 h，離心除去沉淀；然后取上清液繼續(xù)加入固體(NH4)2SO4至飽和度為60%，4 ℃放置過夜，離心收集沉淀。將沉淀溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5）中，然后裝入透析袋中，4 ℃透析12 h，每隔3 h更換一次緩沖液；取適量上述透析液加入預(yù)先用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）平衡過的Sephadex G-100柱中進行洗脫，洗脫速率18 mL/h，分步收集洗脫液，分別測定每管的酶活力。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和濃度的測定

采用LaemmLi法進行SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量[14]；以牛血清白蛋白為標準，采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量[15]。

1.3.5α-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.5.1 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

分別用pH 2.0～7.0的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液和pH 8.0～9.0的0.1 mol/L的Tris/HCl緩沖液配制底物pNPG，將酶液分別加入進行酶促反應(yīng)，測定酶活力，以確定酶的最適pH值；將酶液在不同pH值的緩沖液中于37 ℃條件下分別處理30 min，測定酶活力以研究酶的pH值穩(wěn)定性[16]。按照1.3.2節(jié)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.5.2 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

在標準酶促反應(yīng)體系中，在10～70 ℃溫度條件下分別測定酶活力，確定此α-半乳糖苷酶的最適作用溫度；然后將該酶在35、40、45、50 ℃條件下進行酶促反應(yīng)，并分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時測定剩余酶活力[17]。按照1.3.2節(jié)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.5.3 不同金屬離子對酶活力的影響

在酶促反應(yīng)體系中分別加入金屬離子Na+、Ca2+、Fe2+、K+、Li+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+、Ag+，使金屬離子終濃度為1.0 mmol/L，在37 ℃條件下進行酶促反應(yīng)，以未加入金屬離子的酶液做對照，考察金屬離子對酶活力的影響[18]。以未處理酶液的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.3.5.4α-半乳糖苷酶的底物特異性測定

將蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和瓜爾豆膠溶解于0.1mol/L McIlvaine緩沖液（pH 5.0）中，蜜二糖、棉子糖、水蘇糖質(zhì)量濃度各1 mg/mL，瓜爾豆膠為3 mg/mL。使用2 U的α-半乳糖苷酶分別與1 mL這些底物在40 ℃條件下作用24 h。使用離子交換色譜儀測定半乳糖的釋放量[19]。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3個重復(fù)樣品的平均值，采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，判斷彼此間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 作用時間對酶活力測定的影響

根據(jù)對硝基苯酚標準品的標準曲線獲得回歸方程：y=0.018 2x＋0.002 2（R2=0.999 8）。在酶反應(yīng)的最初階段，在反應(yīng)開始后的2～10 min，反應(yīng)速率最快，反應(yīng)體系中對硝基苯酚的含量呈線性增加，繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)速率逐漸減緩，如圖1所示。在酶化學(xué)反應(yīng)過程中，酶反應(yīng)的瞬時速率很難準確測定，并且反應(yīng)后期反應(yīng)速率下降，因此通常在酶反應(yīng)的最初階段測定初始反應(yīng)速率。在本實驗中，反應(yīng)時間確定為10 min。

圖1 酶反應(yīng)的時間進程Fig.1 Time course of the α-galactosidase-catalyzed reaction

2.2 發(fā)酵過程中α-半乳糖苷酶酶活力變化曲線

菌株KLDS2.0509在pH6.0 TPY培養(yǎng)基中37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，按照1.3.2節(jié)方法測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，其生長曲線和酶活力變化曲線如圖2所示。菌株KLDS2.0509在培養(yǎng)4 h后進入指數(shù)生長期，在培養(yǎng)12 h后達到穩(wěn)定生長期，α-半乳糖苷酶進入對數(shù)生長期后開始產(chǎn)生，進入穩(wěn)定期后酶活力逐漸提高，在穩(wěn)定期中期（24 h）酶活力到達最高值，繼續(xù)培養(yǎng)酶活力呈現(xiàn)下降趨勢，穩(wěn)定期后期酶活力保持穩(wěn)定。

圖2 在培養(yǎng)48 h期間KLDS2.0509所產(chǎn)α-半乳糖苷酶活力和OD600nm的變化Fig.2 Relative activity of α-galactosidase produced by KLDS2.0509 and its optical density at 600 nm as a function of culture time

2.3 酶分離純化

粗酶液先經(jīng)(NH4)2SO4鹽析，再通過透析除雜濃縮，最后濃縮液經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析，結(jié)果如圖3所示。整個洗脫過程出現(xiàn)3個蛋白峰，通過測定各管酶活力，確定α-半乳糖苷酶主要集中在第1個蛋白峰內(nèi)，說明經(jīng)過Sephadex G100凝膠柱層析除去部分小于其分子質(zhì)量的蛋白。

圖3 Sephadex G-100凝膠柱層析洗脫曲線Fig.3 Elution curves of Sephadex G-100 column chromatography

粗酶液經(jīng)過(NH4)2SO4鹽析、透析、Sephadex-G100層析處理后，經(jīng)12.5%的SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖4所示，純化后僅有一條蛋白條帶，說明純化效果較好。根據(jù)相對遷移率分子質(zhì)量的關(guān)系，可以計算出其分子質(zhì)量約為45kD。

圖4 α-半乳糖苷酶SDS-PAGE電泳圖譜EFig.4 SDS-PAGE of α-galactosidase at different separation and purification steps

α-半乳糖苷酶的純化結(jié)果如表1所示，粗酶液的酶比活力1.69 U/mg，酶活力回收率為20.6%，純化倍數(shù)為29.3，純化酶的酶比活力為49.6 U/mg。實驗結(jié)果與已報道的1株短雙歧桿菌的α-半乳糖苷酶活相近，其粗酶液酶比活力為1.76 U/mg[20]，但是低于產(chǎn)α-半乳糖苷酶曲霉的粗酶液酶比活力(1.91 U/mg)[8]，也低于產(chǎn)α-半乳糖苷酶青霉的粗酶液酶比活力(9.6 U/mg)[19]，這與產(chǎn)α-半乳糖苷酶微生物的來源有關(guān)[21-22]。

表1 α-半乳糖苷酶的分離純化Table 1 Purification of α-galactosidase from Bifidibacterium longum KLDS2.0509

2.4 α-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1α-半乳糖苷酶的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

如圖5所示，該α-半乳糖苷酶的最適作用pH值為5.0，該酶在pH 4.5～6.0保持80%以上的相對酶活力。將該酶在不同pH值范圍的緩沖液中37 ℃作用6 h后測其剩余酶活力，結(jié)果如圖6所示，該酶在pH 5.0～6.0時最穩(wěn)定，酶促反應(yīng)6 h后酶活力仍保持在85%以上，隨著pH值升高或者降低，穩(wěn)定性均呈下降趨勢。

圖5 α-半乳糖苷酶最適作用pH值Fig.5 Optimum pH of the α-galactosidase

圖6 α-半乳糖苷酶的pH值穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of the α-galactosidase

2.4.2α-半乳糖苷酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

菌株LB21所產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最適作用溫度為42 ℃，如圖7所示。隨著酶促反應(yīng)溫度的升高，α-半乳糖苷酶酶活力逐漸增強，42 ℃達到最高值，溫度繼續(xù)升高，酶活力顯著降低。

圖7 α-半乳糖苷酶的最適作用溫度Fig.7 Optimum temperature of the α-galactosidase

將該酶在不同的溫度下作用2.5 h，然后測定剩余酶活力，結(jié)果如圖8所示。該酶在40 ℃時，酶活力隨著作用時間延長，呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，但是作用2.5 h后仍然保持65%的酶活力；當(dāng)該酶在35 ℃時，作用2.5 h后，仍剩余82%的酶活力，表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性（P＜0.05）。該酶在50 ℃條件下隨著時間的增加，酶活力迅速下降，1.5 h時完全喪失酶活性。因此該酶對50 ℃以上的高溫較為敏感，但是在42 ℃以下進行酶促反應(yīng)時，具有較高熱穩(wěn)定性。

圖8 α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 Temperature stability of the α-galactosidase

2.4.3 不同金屬離子對α-半乳糖苷酶的影響

金屬離子對該α-半乳糖苷酶酶活力的影響如圖9所示，大多數(shù)的金屬離子對α-半乳糖苷酶的活性沒有明顯影響，F(xiàn)e2+、Mn2+、Ag+和Cu2+對其酶活性有一定抑制作用，Cu2+對其酶活性的抑制最顯著，相對酶活力為21.2%，而Hg2+完全抑制α-半乳糖苷酶的活性，表明該酶的活性中心部位可能存在含巰基的氨基酸（如半胱氨酸）。

圖9 各種金屬離子對α-半乳糖苷酶活力的影響Fig.9 Effects of various metal ions on α-galactosidase activity

2.4.4α-半乳糖苷酶的底物特異性分析

如表2所示，底物特異性測定表明該酶可以有效降解含α-半乳糖苷鍵的蜜二糖、棉子糖和水蘇糖，但不能降解末端含α-半乳糖苷鍵的瓜爾豆膠，對3種底物的降解能力依次為蜜二糖＞水蘇糖＞棉子糖。結(jié)果表明該酶具有降解豆制品中α-半乳糖苷類的寡糖的潛力，可用于消除或降低此類寡糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，從而提高豆制品的利用率，增加豆制品的可食用人群。

表2 α-半乳糖苷酶水解蜜二糖、棉子糖、水蘇糖后半乳糖的釋放量Table 2 Release of galactose from melibiose, raffinose and stachyose hydrolyzedd bbyy α-galactosiiddaassee

3 結(jié) 論

長雙歧桿菌KLDS2.0509α-半乳糖苷酶分子質(zhì)量約為45 kD，純化后的酶比活力為49.6 U/mg，最適作用pH值為5.0，酶活力隨著pH值升高或者降低，均呈下降趨勢；最適溫度42 ℃，溫度繼續(xù)升高，酶活力顯著下降。大多數(shù)的金屬離子對酶的活性無顯著影響，F(xiàn)e2+、Mn2+、Ag+和Cu2+能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生抑制作用，而Hg2+完全抑制酶活性；酶的底物特異性實驗結(jié)果表明，該酶可降解蜜二糖、棉子糖和水蘇糖，但不能降解末端含α-半乳糖苷鍵的多糖。該酶在40 ℃條件下保溫2.5 h后仍然保持65%的酶活力，表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

[1]CHROST B, SCHMITZ K.Purification and characterization of multiple forms ofα-galactosidase inCucumis meloplants[J].Journal of Plant Physiology, 2000, 156(4): 483-491.

[2]FUJIMOTO Z, KANEKO S, KIM W, et al.The tetramer structure of the glycoside hydrolase family 27α-galactosidase I fromUmbelopsis vinacea[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2009, 73(10):2360-2364.

[3]梁素鈺, 鄭學(xué)勤.具血型轉(zhuǎn)換功能的咖啡α-半乳糖苷酶基因的克隆與表達[J].遺傳, 2005, 27(5): 759-764.

[4]KATROLIA P, JIA Huiyong, YAN Qiaojuan, et al.Characterization of a protease-resistantα-galactosidase from the thermophilic fungusRhizomucor mieheiand its application in removal of raffinose family oligosaccharides[J].Bioresource Technology, 2012, 110: 578-586.

[5]LILLA S D, NGUYEN Q D, DOMINIKA D L, et al.Effects of galactomannan as carbon source on production ofα-galactosidase byThermomyces lanuginosus: fermentation, purification and partial characterization[J].Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45(5):367-371.

[6]SIMERSKA P, MONTI D, CECHOVA I, et al.Induction and characterization of an unusualα-D-galactosidase fromTalaromyces fl avus[J].Journal of Biotechnology, 2007, 128(1): 61-71.

[7]許堯興, 李艷麗, 柳永, 等.黑曲霉變種RM48α-半乳糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2009, 35(2): 147-152.

[8]王劍鋒, 王璋, 李江, 等.黑曲霉耐酸性α-半乳糖苷酶的分離及其酶學(xué)性質(zhì)[J].食品科學(xué), 2012, 33(21): 267-270.

[9]李蘇紅, 朱旻鵬, 李拖平.重組水稻α-半乳糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué), 2010, 31(21): 304-307.

[10]郝桂娟, 張凱, 王學(xué)智, 等.α-半乳糖苷酶的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī), 2013, 40(3): 149-154.

[11]陳俊亮, 楊麗杰, 霍貴成.產(chǎn)α-半乳糖苷酶乳酸菌的鑒定及其發(fā)酵性能研究[J].山東大學(xué)學(xué)報: 理學(xué)版, 2008, 43(7): 28-39.

[12]SCALABRINI P, ROSSI M, SPETTOLI P, et al.Characterization ofBifidobacteriumstrains for use in soymilk fermentation[J].International Journal of Food Microbiology, 1998, 39: 213-219.

[13]TSANGALIS D, SHAH N P.Metabolism of oligosaccharides and aldehydes and production of organic acids in soymilk by probiotic bifidobacteria[J].International Journal of Food Science and Technology, 2004, 39: 541-554.

[14]LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature, 1970, 227: 680-685.

[15]LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].The Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1): 265-275.

[16]DONKOR O N, HENRIKSSON A, VASILJEVIC T, et al.α-Galactosidase and proteolytic activities of selected probiotic and dairy cultures in fermented soymilk[J].Food Chemistry, 2007, 104: 10-20.

[17]LEBLANC J G, SILVESTRONI A, CONNES C.Reduction of nondigestible oligosaccharides in soymilk: application of engineered lactic acid bacteria that produceα-galactosidase[J].Genetics and Molecular Research, 2004, 3(3): 432-440.

[18]CARRERA-SILVA E A, SILVESTRONI A, LEBLANC J G, et al.A thermostableα-galactosidase fromLactobacillus fermentumCRL722:genetic characterization and main properties[J].Current Microbiology,2006, 53: 374-378.

[19]密士軍, 柏映國, 孟昆.一種來源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)報, 2007, 47(1): 156-160.

[20]肖敏, 劉樹峰, 朱崇日, 等.短雙歧桿菌α-D-半乳糖苷酶的純化及性質(zhì)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2001, 21(3): 307-311.

[21]李孝輝, 陳聲明.生物源α-半乳糖苷酶的研究進展[J].微生物學(xué)通報, 2002, 29(2): 71-75.

[22]DONKOR O N, HENRIKSSON A, VASILJEVIC T, et al.α-Galactosidase and proteolytic activities of selected probiotic and dairy cultures in fermented soymilk[J].Food Chemistry, 2007, 104(1): 10-20.