沈 潔，劉昱均，胡學(xué)一

江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，無錫 214122

真菌在中國醫(yī)術(shù)歷史中起到重要作用，《神龍本草經(jīng)》、《本草綱目》中記錄的真菌類藥物有20 多種。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到真菌類多糖及其復(fù)合物分子不僅僅只是能量載體，更具備許多生物功能活性，能夠參與調(diào)解多種生命現(xiàn)象，例如:分子識(shí)別、細(xì)胞粘接與融合、調(diào)節(jié)信號(hào)通路、分子免疫與分子應(yīng)答、細(xì)胞分化與細(xì)胞代謝等［1］。

真菌通過野外采集或人工栽培，采用子實(shí)體入藥，其生長周期長、勞動(dòng)強(qiáng)度大，成分比例不穩(wěn)定、受自然因影響較大，使得大量使用真菌類藥物受到限制［2］。隨著液體深層發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，多種真菌的深層發(fā)酵技術(shù)日益完善，具有原料易得、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。采用液體深層發(fā)酵技術(shù)制備的菌絲體，其真菌類活性成分往往也比子實(shí)體中的多，且容易獲得，為大規(guī)模生產(chǎn)創(chuàng)造標(biāo)準(zhǔn)化、集約化的有利條件。

1 多糖的提取與處理

多糖存在于細(xì)胞壁或者胞間質(zhì)中，與細(xì)胞壁或者胞間質(zhì)常以氫鍵或離子鍵結(jié)合，因此不同種類的多糖需要采用不同的方法來破壞多糖與各有機(jī)體的結(jié)合力［3］。提取多糖的方法大體相同，都是利用多糖可溶于水、酸、堿等溶劑，而不溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)。通過細(xì)胞破壁的方式，將多糖分子從細(xì)胞壁或者胞間質(zhì)中釋放;溶解出的多糖經(jīng)過脫蛋白、脫色素、乙醇沉淀等后續(xù)處理步驟，最后經(jīng)過冷凍干燥獲得粗多糖。

1.1 多糖的提取

多糖為極性大分子化合物，利用多糖可溶于水的特點(diǎn)，考察不同的提取溫度、溶劑加入量、提取時(shí)間對多糖得率的影響。提取溶劑多為水、酸和堿，提取溫度與溶劑緊密相關(guān)，在酸性條件下提取溫度不宜太高，以防止多糖分子降解，因此常在提取液中加入硼氫化鈉防止氧化。為了避免多糖在提取過程中分解，多在溫和條件下加入特定的生物酶來輔助提取多糖，常用的有纖維素水解酶、果膠酶和蛋白酶。馬長清等［4］用纖維素酶提取的香菇多糖其得率比單純熱水提取的高出54%，具有理想的提取效果。沈愛英等［5］聯(lián)合使用纖維素酶，果膠酶和蛋白酶提取姬松茸子實(shí)體多糖，結(jié)果表明其提取率高于水提、堿提和酸提，提取時(shí)間僅為水提法的一半。林魁等［6］研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能顯著提高雙孢蘑菇多糖的提取效率;梁敏等［7］

用木瓜蛋白酶、纖維素酶復(fù)合提取香菇多糖并確定其最佳工藝條件，最終使得提取率比傳統(tǒng)水提法提高了8%。

除了使用不同的酶來水解多糖所處的纖維素、蛋白質(zhì)、果膠等不同環(huán)境外，微波輔助提取和超聲輔助提取也廣泛應(yīng)用于多糖的提取。微波輻射能夠穿透介質(zhì)到達(dá)待提取的物料，極性物質(zhì)在微波輻射過程中有較強(qiáng)的吸收，使得分子的偶極矩發(fā)生變化，發(fā)生分子振動(dòng)，從而加熱物料使得細(xì)胞內(nèi)部的水分氣化，產(chǎn)生的壓力使得細(xì)胞壁破碎，從而釋放體系中的多糖。王美珠等［8］研究了微波輔助提取香菇多糖，并與常規(guī)熱水提取方法比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提取多糖的時(shí)間縮短200%、多糖得率提高了35%。用微波輔助提取黑靈芝孢子粉多糖除了能提高多糖的得率及純度以外，還具有快速高效、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)［9］。易鵬［10］等研究了微波提取茯苓多糖的工藝，發(fā)現(xiàn)微波功率對茯苓多糖提取的影響最大。張桂春等［11］采用微波輔助法提取發(fā)酵灰樹花多糖。該多糖經(jīng)570W 的微波處理4.5 min 再用熱水提取2 h后具有最高的得率。超聲波輔助提取多糖是利用了超聲波的“空化”作用，使得細(xì)胞壁發(fā)生破裂，多糖可以迅速擴(kuò)散到溶劑中。尤麗君等［12］采用超聲—高溫?zé)崴崛∠愎蕉嗵?，最終得率為15.7%，為傳統(tǒng)水提得率的1.4 倍，并且超聲提取的多糖其三螺旋結(jié)構(gòu)更加完整。這表明用超聲法提取香菇多糖在得率上優(yōu)于傳統(tǒng)水提法，并且從多糖結(jié)構(gòu)上來看超聲提取的多糖更具有生物活性。姜寧等［13］考察了超聲波提取金針菇菌絲體多糖的工藝條件。結(jié)果表明在超聲功率80 w、超聲時(shí)間10 min、料液比1∶100、pH8.0 這一最佳工藝條件下，多糖得率為3.46%。與水浴法提取金針菇菌絲體多糖相比，超聲法提高了多糖得率，而且縮短了提取時(shí)間，是一種高效的提取方法。但是劉娜女［14］等研究發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取雞腿菇多糖過程中，超聲會(huì)破壞多糖的C=O 鍵從而形成C-O;使得多糖的螺旋聚集體發(fā)生降解，因此超聲法提取多糖還是受到了一定的限制。

1.2 多糖的后續(xù)處理

采用浸提法獲得的多糖溶液中含有大量的雜質(zhì)，需要進(jìn)一步除去，常見的雜質(zhì)有蛋白、寡糖、色素及其他小分子物質(zhì)［15］。

1.2.1 脫蛋白

采用浸提法獲得的多糖溶液中含有大量可溶性蛋白，部分蛋白以游離蛋白的形式存在，部分以結(jié)合蛋白的形式存在。脫除蛋白的原理大體相似，都是通過脫蛋白試劑使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性，以沉淀的形式分離除去;主要的方法有:Sevag 法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法［16］。

Sevag 法是最溫和的除蛋白方法，利用蛋白質(zhì)在氯仿溶液中發(fā)生變性，沉淀后離心去除。Sevag 試劑為氯仿與正丁醇體積比為4∶1 的混合液，在去蛋白過程中，加入20%的Sevag 試劑，高速攪拌20 min后離心分離變性蛋白，經(jīng)過反復(fù)多次可除去多糖中的游離蛋白。

三氟三氯乙烷法是一種高效、簡單的去蛋白方法，將三氟三氯乙烷直接加入多糖溶液中攪拌20 min 后離心，收集水相。由于三氟三氯乙烷沸點(diǎn)低易揮發(fā)且有一定的毒性，使用中受到一定的限制。

三氯乙酸法是一種簡單的去蛋白方法，在多糖溶液中加入5%的三氯乙酸靜置過夜，離心收集上層清液。但其反應(yīng)劇烈，且容易使多糖分子鏈斷裂，故常在5oC 條件下進(jìn)行，因此不適合應(yīng)用在多糖溶液體系。

1.2.2 脫色素

采用浸提法獲得的多糖溶液中含有一些色素，部分色素以游離式存在，部分以結(jié)合色素形式存在。常用的脫色方法有:雙氧水脫色法、活性炭脫色法和樹脂層析法［17］。

雙氧水脫色法是利用雙氧水的氧化性將色素的發(fā)色基團(tuán)氧化，但被氧化后的色素雜質(zhì)并未脫離體系，仍需要進(jìn)行后續(xù)的處理。使用雙氧水脫色過程時(shí)，雙氧水的濃度不易過高，否則會(huì)導(dǎo)致多糖的還原性官能團(tuán)被氧化。

活性炭脫色法在多糖脫色應(yīng)用中受到眾多限制，活性炭脫色法是利用活性炭吸附色素分子達(dá)到去除色素的目的，但活性炭也會(huì)吸附多糖造成多糖損失，而一些酚類色素由于帶有負(fù)電荷不易被活性炭吸附。

樹脂層析法是利用色素的電負(fù)性吸附色素達(dá)到去除色素的目的，酚類色素由于帶有負(fù)電荷，常常使用弱堿性離子交換樹脂吸附色素，常使用DEAE 纖維素樹脂。如果是結(jié)合色素，DEAE 有很強(qiáng)的吸附性，不能被水洗脫，則考慮使用雙氧水脫色法脫色。

1.2.3 除去低聚糖等小分子雜質(zhì)

傳統(tǒng)的去除小分子雜質(zhì)的方法多選用透析法，利用濃度差產(chǎn)生的推動(dòng)力使得透析袋內(nèi)的雜質(zhì)透析到體系外。超濾法相比透析法而言具有通量大、效率高等優(yōu)勢，通過外加壓力加快透析速度，同時(shí)超濾過程中可以將體系中的水分子分離，得到濃縮的多糖，便于后續(xù)處理［18］。

1.2.4 多糖的純化

純化多糖的常用方法主要有以下幾種:分級(jí)沉淀法、纖維素陰離子交換柱法以及凝膠柱層析法［19］。分級(jí)沉淀法是利用多糖分子在加入有機(jī)溶劑后其在溶液中溶解度的改變，使得不同分子量范圍的多糖在加入不同量有機(jī)溶劑的溶液中逐級(jí)分步析出。通常情況下以乙醇為為沉淀劑，乙醇的體積分?jǐn)?shù)一般選取30%、50%、70%和90%，獲得四個(gè)沉淀組分。該方法主要用于分離溶解度差異較大的多糖體系。纖維素陰離子交換柱法是利用不同多糖對樹脂的吸附能力不同，通過不同濃度的鹽溶液洗脫，可以將不同吸附能力的多糖置換;多糖的吸附能力與其結(jié)構(gòu)和帶電性有關(guān)，一般而言，直鏈多糖應(yīng)為空間位阻小，其吸附能力比支鏈多糖大，分子量大的多糖吸附能力強(qiáng)，酸性多糖比中性多糖的吸附能力強(qiáng)。該方法適合于分離酸性多糖、中性多糖和粘多糖。凝膠柱層析法常用的填料有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，利用不同分子量的多糖通過凝膠填料的難易程度不同，分子量大的多糖先被洗出，分子量小的多糖保留時(shí)間長后被洗出，從而達(dá)到分離的目的，此方法只適合分離粘多糖。

2 多糖的化學(xué)改性

一些多糖的活性與其所含的化學(xué)基團(tuán)有密切的聯(lián)系，多糖的衍生化反應(yīng)主要有硫酸酯化、羧甲基化、和乙?；Ｆ渲辛蛩狨セ难芯勘容^火熱，研究發(fā)現(xiàn)天然的海藻多糖含有最多的硫酸酯鍵——硫酸根取代度為3，其具有抗HIV 病毒活性［20］;天然香菇多糖具有很強(qiáng)的腫瘤抑制活性，經(jīng)過硫酸酯化改性過后，腫瘤抑制活性下降甚至消失，但抗HIV病毒活性卻大大提高［21］。

2.1 硫酸酯化

多糖的硫酸酯化合成方法有Wolfrom(氯磺酸-吡啶法)法、SO3-吡啶法、濃硫酸法［22］。其中Wolfrom 法應(yīng)為操作簡單，反應(yīng)物易得等原因被廣泛使用。

一些多糖本身沒有體外抗腫瘤活性，經(jīng)過硫酸酯化后便具備了一定的抗腫瘤活性;一些本身抗腫瘤活性不強(qiáng)的多糖經(jīng)過硫酸酯化后抗腫瘤活性增強(qiáng)。Zhu 等［23］研究了發(fā)酵冬蟲夏草多糖，經(jīng)過硫酸酯化改性后的多糖對K562 的抑制率提高60%，但抗氧化能力下降50%;Wei 等［24］研究了紅芪多糖，經(jīng)過硫酸酯化改性后的多糖對A549 和BGC-823 有顯著的抑制作用，并且都將細(xì)胞的生長周期抑制在G1 期。

2.2 羧甲基化

多糖的羧甲基化采取的一般步驟為:將多糖在95 ℃下用30%的NaOH 溶液處理2 h，殘?jiān)粗林行院髴腋≡?.06%的氯乙酸溶液中，用乙酸調(diào)節(jié)pH 至4.5，于50oC 下震搖6 h。

一些多糖本身沒有抗腫瘤活性，經(jīng)過羧甲基化后便具備了一定的抗腫瘤活性。例如:Wiater 等［25］研究了羧甲基化平菇多糖，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細(xì)胞的線粒體代謝有顯著的抑制作用，而未羧甲基化的平菇多糖則不具備這個(gè)活性;Zhang 等［26］研究了羧甲基化蘑菇多糖，發(fā)現(xiàn)其對HL-60 腫瘤細(xì)胞的IC50僅為42 mg/mL，比未羧甲基化蘑菇多糖的半致死量減少了40%;Xu 等［27］對子實(shí)體靈芝多糖進(jìn)行了羧甲基化改性，發(fā)現(xiàn)其濃度為5 mg/mL 下體外抗羥基自由基達(dá)到87%，比改性前提高了30%。

2.3 乙?；?/h3>

乙?；嗵鞘侵匾亩嗵侵ф湼男匝苌铩Ｒ阴；男允沟枚嗵擎湴l(fā)生伸展，使包裹在體系內(nèi)的羥基暴露在外，進(jìn)而改善多糖的水溶性。隨著乙?；黾?，糖鏈的伸展程度增加，羥基暴露程度增加，多糖溶解度增大，抗腫瘤活性增強(qiáng);但隨著乙?；潭燃由?，羥基數(shù)量變少，反而使得溶解度降低，失去抗腫瘤活性;Hu 等［28］研究了乙?；难蚨蔷嗵窃?00 μg/mL 濃度下能使HepG2 細(xì)胞發(fā)生凋亡;Ma 等［29］研究了乙酰基化的蘑菇多糖，發(fā)現(xiàn)其抗脂質(zhì)過氧化性明顯增強(qiáng)。

3 真菌多糖的抗腫瘤活性

真菌多糖主要有兩種抗腫瘤方式——直接作用于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性和通過免疫系統(tǒng)抑制腫瘤細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)免疫功能。在直接抗腫瘤方面，Wu et al.［30］發(fā)現(xiàn)來自Armillaria mellea 的多糖AMP 通過阻斷肺癌細(xì)胞A549于G0/G1 期來抑制細(xì)胞生長。另外AMP 也能降低A549細(xì)胞線粒體膜電位，釋放細(xì)胞色素C 來發(fā)揮抗腫瘤作用。云芝多糖PSK 通過提高p21(WAF)/(CiP1)的表達(dá)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞程序性死亡［31］。另有研究表明，發(fā)酵Trichoderma pseudokoningii 多糖EPS 可抑制血癌細(xì)胞K562 增殖，該作用主要通過線粒體信號(hào)通路來上調(diào)Bax 和p53 mRNA 表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 mRNA 表達(dá)，最終導(dǎo)致K562 細(xì)胞凋亡［32］。黑靈芝多糖PSG-1 對肉瘤細(xì)胞S-180 的凋亡作用主要由Bcl-2 蛋白表達(dá)的降低、線粒體膜電位的下降和activation of caspase-3 and -9的活化這幾個(gè)因素構(gòu)成［33］。Miao et al.［34］研究了源于Lepista sordida 多糖LSPc1 的抗腫瘤機(jī)制。該多糖促使細(xì)胞周期停留在G2/M 期，并且提高了Bax/ Bcl-2 表達(dá)比值和caspase-3 and -9 的活性。另外富含硒的靈芝多糖以激活聚合酶ADPribose 的方式來達(dá)到直接抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 增殖的效果［35］。在免疫調(diào)節(jié)方面，黑靈芝多糖PSG-1 能活化免疫細(xì)胞使其釋放細(xì)胞因子IFN-α、IL-1β 和NO 以抑制CT26 細(xì)胞增殖［36］。Sun et al.［37］研究發(fā)現(xiàn)Huaier 多糖之所以能刺激免疫細(xì)胞釋放NO 是因?yàn)槠浼ぐl(fā)了NO 合成因子(iNOS)的活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的氧化受損是誘發(fā)腫瘤的主要原因之一。解決該問題的根本途徑就是有效清除活性氧。研究指出，來自Pleurotus abalonus 的子實(shí)體多糖通過抗氧化、清除氧自由基發(fā)揮抗腫瘤作用［38］。有文獻(xiàn)報(bào)道了靈芝多糖顯著降低氧自由基、DPPH自由基、氫氧根自由基的含量，減少了細(xì)胞被氧化的概率［39］。由此可見，多糖對清除自由基方面很有成效。

4 結(jié)論

真菌多糖是中藥活性成分研究的一大熱點(diǎn)。其多種生物活性與低毒性等特點(diǎn)使真菌多糖直接或作為先導(dǎo)化合物間接發(fā)展成藥物。隨著研究的不斷深入，真菌多糖的提取、分離、合成以及制藥工藝的進(jìn)一步發(fā)展，將會(huì)開發(fā)出越來越多的藥用真菌多糖。

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