汪友明，馬忠友，胡豐林，樊美珍，李增智

1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 合肥 230036;2 安徽科技學(xué)院生物系 蚌埠 233100;3安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點實驗室 合肥 230036

紫杉醇(Taxol，商品名Paclitaxe1)是從紅豆杉樹皮中提取的一種二萜類生物堿，是近十幾年來獲得的療效顯著的天然廣譜抗癌藥物，是目前全球銷售量最大的抗癌藥物［1-3］。目前研究生產(chǎn)紫杉醇的方法主要有四種:①從紅豆杉植物直接提取;②化學(xué)半合成;③從紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)物中提取;④從產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵代謝物中提取。由于紅豆杉已經(jīng)作為瀕危物種被列為國家一級保護(hù)植物，顯然從紅豆杉植物組織中提取已受到極大的限制，同時紅豆杉樹皮中紫杉醇含量很低，藥源極其有限，遠(yuǎn)不能滿足臨床用藥需要。紅豆杉細(xì)胞組織培養(yǎng)需要的條件嚴(yán)格且產(chǎn)量低而化學(xué)合成成本昂貴，因此這兩種途徑均不適合大量獲取紫杉醇。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇，它不需依賴紅豆杉而極具工業(yè)化生產(chǎn)潛力的方法。特別是自1993 年Stierle 與Strobel等首次報道了從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中分離到一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)，其紫杉醇含量為24～50 μg/L，為人們展示了一個可能生產(chǎn)紫杉醇的誘人的新途徑［4］。國內(nèi)在云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)、南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)和東北紅豆杉(Taxus cuspidata)等紅豆杉屬植物中已分離到產(chǎn)紫杉醇或其類似物的內(nèi)生真菌，為紫杉醇的微生物工程提供了更廣闊的途徑［5-7］。本文主要從安徽黃山地區(qū)采集紅豆杉植物樣本進(jìn)行內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)、鑒定、產(chǎn)紫杉醇菌篩選的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)樹根、嫩枝、針葉和樹皮樣本采自安徽省黃山旅游分景區(qū)外圍，樹徑為30～100 cm，海拔800～980 m。樣品采集后迅速裝入無菌塑料袋，4 ℃保存。并由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點實驗室的李增智教授鑒定。

1.2 試劑和細(xì)胞株

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品購于sigma 公司，青霉素鈉與鏈霉素購于中國華北制藥公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。中國倉鼠卵巢CHO 細(xì)胞株，購于中國科技大學(xué)免疫學(xué)實驗室。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基選用PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉5 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃，20 min 滅菌，冷卻至60～70 ℃倒入25 mg/L 鏈霉素。液體培養(yǎng)基選用PDA 培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.4 內(nèi)生真菌分離和純化

將新鮮的植株樣本用水洗凈，葉片切成1 cm2小塊;根與皮切成lcm 左右的小段(兩端均需有切口)。把葉片和根莖段依次浸泡于75%酒精3 min，1%次氯酸鈉溶液(含游離氯＞2.5%)10～15 min，75%酒精再浸泡2～3 min 進(jìn)行消毒以去除表面污染菌株，再用含有抗生素的PDA 培養(yǎng)基平板25 ℃培養(yǎng)。待菌落從切口處長出后，按常規(guī)方法對分離出的菌落進(jìn)行純化，以供鑒定和保藏。

1.5 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的提取

將分離純化后得到的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，用無菌PDA 液體培養(yǎng)基將真菌菌絲體和孢子洗下接人250 mL 三角瓶，放入25 ℃(±0.5)，轉(zhuǎn)速為150 rpm的全控溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液抽濾，分離出發(fā)酵液，將菌絲體刮下后冷凍干燥備用。發(fā)酵液采用低溫真空濃縮處理，濃縮至原體積的1/5 后用等體積的氯仿和乙酸乙酯萃取多次后，將有機(jī)相濃縮近于1ml 備用。

1.6 代謝產(chǎn)物檢測

1.6.1 薄層層析分析(TLC)

用標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對照，樣品用毛細(xì)管點到已活化的GF254高效薄層層析硅膠板上，并成一點，點的直徑控制在2 mm 以內(nèi)。將硅膠板放入層析缸中展開，層析后取出硅膠板，用噴霧器在薄層板上均勻地噴上顯色劑，在100 ℃的烘箱中顯色約10 min 左右，觀察斑點的大小、位置和顏色。

1.6.2 高效液相色譜分析(HPLC)

利用HPLC 建立紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，用高效液相色譜(HPLC)測定，條件為:流動相為甲醇:水(v/v)=65∶35;反向C18柱(Waters4.6 ×250 mm，5 μm，ODS2)，流速1 mL/min，檢測波長228 nm.將樣品發(fā)酵液5000 rpm 離心，蒸發(fā)濃縮一定程度加入等體積的乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，然后加人按一定比例配好的三氯甲烷和水萃取后，將三氯甲烷相蒸發(fā)至干，用甲醇溶解后離心，取上清液上高效液相色譜做定量檢測。

1.7 細(xì)胞毒性實驗

CHO 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后加新鮮培養(yǎng)液，于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 天換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長到對數(shù)分裂期，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到96 孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)24 h 且貼壁后，用移液器吸出舊的培養(yǎng)液，然后每孔加90 μL 新鮮培養(yǎng)液和10 μL 樣品，同時設(shè)100%對照組、0%對照組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。酶標(biāo)儀檢測，計算抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)生菌的篩選

從安徽黃山地區(qū)紅豆杉中分離出來107 多株內(nèi)生真菌，通過液體培養(yǎng)后TLC 法的初步篩選發(fā)現(xiàn)共有8個菌株的發(fā)酵液提取物在薄層板上均能產(chǎn)生紫杉醇的特征性斑點出現(xiàn)，其Rf均與紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)品相同［見圖1］。將8個菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC復(fù)篩檢測。在一定的檢測波長下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HQ-24菌株代謝產(chǎn)物的紫杉醇的吸收峰與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時間一致。因此初步判定該菌株代謝物能產(chǎn)紫杉醇(見圖2，圖3)。

圖1 安徽紅豆杉內(nèi)生真菌培養(yǎng)物的薄層層析Fig.1 Thin layer chromatograph of the organic extract the endophytic fungus from Taxus anhuiensis

圖2 紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of taxol standard sample

圖3 HQ-24 代謝物的HPLC 圖譜Fig.3 The HPLC chromatogram of the organic extract of HQ-24

2.2 目標(biāo)菌株細(xì)胞毒性測定結(jié)果

將HQ-24 菌株發(fā)酵液凍干品用12.5%的DMSO 配成1.0 mg/mL 的樣品溶液，用CHO Cytotoxicity Assay 模型進(jìn)行測定，樣品的測試終濃度為100 μg/mL。細(xì)胞毒性測定結(jié)果抑制率為71.28%(±1.22)，由此可見HQ-24 菌株的代謝物細(xì)胞毒較大，結(jié)合HPLC 定量分析，該菌株值得作進(jìn)一步研究。

2.3 目標(biāo)菌株的生理特征和鑒定

菌株HQ-24 在查氏培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)8～10天直徑可達(dá)到36～48 mm，菌落致密，質(zhì)地絨狀，平展，菌落白色，無滲出液，無特殊氣味，邊緣整齊;菌落背面淡黃色，中央無隆起，有樹枝狀皺紋。

菌絲無色，有隔膜。分生孢子梗從壁厚而較細(xì)的菌絲細(xì)胞生出，稍彎，大多數(shù)無隔膜，光滑，上部較粗大，頂端膨大成橢圓形的泡囊;從泡囊的全部表面以放射狀生出小梗，初為輻射狀，后呈疏松柱形，直徑15～25 X 25～40 μm。分生孢子串生于小梗頂端，作輻射狀排列，單個孢子球形或亞球形和橢圓形，直徑為1.7 μm～2.3 μm，小，無隔膜，光滑，無色，根據(jù)HQ-24 菌株上述特征判定為曲霉(Aspergillus sp.)。(見圖4)。

圖4 HQ-24 菌株顯微形態(tài)Fig.4 The photomicrography of HQ-24

2.4 討論

研究表明:經(jīng)過TLC 和HPLC 檢測，可以證實HQ-24 菌株發(fā)酵次生代謝物可以產(chǎn)紫杉醇類化合物，通過CHO Cytotoxicity Assay 模型測定，說明該菌株代謝物細(xì)胞毒較大，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，最后對該菌株的形態(tài)學(xué)鑒別，初步判定HQ-24 菌株屬于曲霉屬(Aspergillus)。從其HPLC 圖譜可以看出，目標(biāo)化合物的色譜峰非常小，其它不明物的色譜峰較多較強(qiáng)，這說明在HQ-24 發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇類化合物含量較低，而其它化學(xué)成分較多。

至今已經(jīng)有許多關(guān)于產(chǎn)紫杉醇真菌的研究，也反映了產(chǎn)紫杉醇真菌的多樣性［8，9］。大量研究結(jié)果表明，紅豆杉組織中紫杉醇的含量與其種屬沒有明顯的相關(guān)性，而其產(chǎn)生紫杉醇的能力是否也與宿主紅豆杉生長的地理位置及其生態(tài)環(huán)境存在相關(guān)性尚待進(jìn)一步研究［10］。本研究中所得紫杉醇，雖然經(jīng)TLC、HPLC 檢測，但仍然需要從科學(xué)的角度進(jìn)一步證明。內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的遺傳基因是否穩(wěn)定，紫杉醇的含量是否穩(wěn)定，也有待進(jìn)一步研究，從目前來看內(nèi)生菌產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量與工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離。如果能找到內(nèi)生菌中的產(chǎn)紫杉醇的基因，并利用所分離得到的紫杉醇產(chǎn)生菌構(gòu)建工程菌株將是工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的一條可行途徑。

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