王良宏，楊 麗，潘 衛(wèi)，李 興，楊國珍△

（1.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，貴州貴陽550009；2.四川大學華西第二醫(yī)院生殖中心，四川成都610041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）嚴重危害人類健康，目前臨床常用的抗病毒藥物對慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的治療效果并不十分理想，藥物不能有效地阻止HBV在細胞內(nèi)的復制和再感染。HBV感染早期，病毒與細胞相互作用的機制并不清楚，這可能會影響到藥物的設計與治療方案的更新。HBV通過外膜蛋白與肝細胞膜上的特異受體相互識別，黏附于細胞膜上［1］，這種特異性的識別和黏附是HBV感染嗜性（組織和宿主特異性）的原因之一。大量研究顯示，HBV的preS1肽段不僅直接參與了病毒與細胞的結合，而且其作用是十分關鍵和必需的［2－3］。肝細胞受體識別位點在preS1的21～47表位［4－7］。本課題以人肝癌細胞（HepG2）為實驗對象，采用免疫磁珠法分離與preS1肽段結合的受體蛋白［8］，以期發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關的受體蛋白，從而為HBV感染早期與細胞相互作用機制的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：HepG2細胞購自中國科學院細胞庫。試劑：生物素標記preS1肽段購自賽百盛生物公司，鏈霉親和素標記的磁珠購自柏匯申生物科技有限公司，細胞核－細胞質－細胞膜制備試劑盒購自普利萊基因技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、雙抗（青霉素100U／mL，鏈霉素100mg／mL）的DEME高糖培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)HepG2細胞。

1.2.2 細胞膜蛋白的提取 收集大約2×107個細胞，嚴格按照細胞核－細胞質－細胞膜制備試劑盒的說明書進行提取。

1.2.3 免疫磁珠法分離與preS1結合的蛋白 取2mg膜蛋白同300μL生物素標記的preS1，加PBS至1mL，4℃孵育過夜。次日取出后加入濃度為0.15g／L的鏈霉親和素標記磁珠300μL，補足PBS至1 200μL，37℃搖床孵育30min。將Epp管插入磁力架，吸出未結合的部分，然后用PBS將磁珠洗滌3次，棄PBS，加入裂解液30μL冰浴30min，將與preS1結合的蛋白裂解出來。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白 將裂解的蛋白液用5%的濃縮膠，12%的分離膠進行SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍R-250染色，UMAX掃描儀進行掃描。

1.2.5 質譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索 選取在凝膠中顏色較深且重復性好的6條帶進行質譜鑒定。LC-MS／MS質譜分析及檢索由中國科學院動物研究所生物膜與膜生物工程國家重點實驗室完成。

2 結 果

2.1 HepG2細胞膜蛋白與preS1結合蛋白的分離結果2mg HepG2膜蛋白與300μg的preS1結合，經(jīng)300μL鏈霉親和素標記磁珠獲得的結合蛋白，通過SDS-PAGE分離出了16條帶（圖1），（45～97）×103的有9條帶，＞97×103的有5條帶，＜20×103的有2條帶。

2.2 HepG2細胞膜蛋白與preS1結合蛋白的質譜分析 選取其中顏色較深且重復性好的6條帶（圖1）進行了質譜分析，成功分析出14個蛋白，除Act1p屬酵母菌科外，其余均為人的種屬。剩余的13個蛋白包含肌動蛋白β（actin，beta）、微管蛋白β（Tubulin，beta）、ATP合酶（ATP synthase）、微管蛋白α－1A鏈（Tubulin alpha-1Achain）、熱休克蛋白60（60kDa heat shock protein，HSP60）、角蛋白1（keratin 1）、keratin 10、表皮細胞角蛋白2（epidermal cytokeratin 2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78（78kDa glucose-regulated protein precursor，GRP78）、熱休克蛋白70（Heat shock 70kDa protein 9，Mortalin）以及3個未命名的蛋白。質譜鑒定獨立肽段數(shù)大于或等于2，評分小于或等于1E-5為結果可靠，各蛋白質譜分析結果，見表1。

圖1 SDS-PAGE分離HepG2膜蛋白與preS1結合蛋白

表1 HepG2與preS1結合蛋白的質譜結果

3 討 論

HBV嚴重危害人類健康，目前臨床常用的抗病毒藥物對CHB的治療效果并不十分理想，藥物不能有效地阻止HBV在細胞內(nèi)的復制和再感染。HBV感染早期，病毒與細胞相互作用機制的研究顯得尤為重要。

本課題采用了免疫磁珠分離法，該方法是一種省時、省力、方便快捷的方法，可有效分離受體蛋白［8］。本研究成功分離鑒定出14種與preS1肽段結合的蛋白，主要包括以下幾類。（1）微管蛋白：微管蛋白β，微管蛋白α-1A鏈。微管是構成細胞骨架的主要成分，它由微管蛋白β和微管蛋白α兩個亞基結合在一起。維持細胞的形態(tài)，可影響膜內(nèi)細胞器的空間定位和分布，參與物質運輸及細胞內(nèi)信號轉導。（2）線粒體相關蛋白：ATP合酶。線粒體上的ATP合酶是一個與ATP合成和水解相關的雙向酶復合物。ATP合酶主要存在于線粒體內(nèi)膜，但已有研究表明在細胞表面也存在ATP合酶［9］，并且最近的研究表明ATP合酶可作為受體參與脂類代謝調(diào)控和腫瘤免疫標志識別等［10］。（3）HSP：HSP60、Mortalin、GRP78。HSP是一類所有細胞在應激狀態(tài)下，由熱休克基因編碼合成的序列高度保守的蛋白，且能夠對抗更為嚴重的應激損傷，這種現(xiàn)象稱為熱休克反應。HSP 60作為線粒體蛋白主要表達在細胞質［11］，涉及線粒體蛋白和大分子的組裝，有利于輸入蛋白的正確折疊，在線粒體基質中正確的產(chǎn)生多肽。王芳等［12］在文中指出，HBV感染的肝細胞會釋放大量的可溶性HSP60分子，其表達水平與HBV-DNA水平呈正相關。Mortalin和GRP78均屬于HSP70家族。Mortalin主要定位于線粒體，參與天然免疫和獲得性免疫，有研究指出Mortalin是一種功能性膜蛋白，在細胞信號傳導中扮演著重要角色。

GRP78主要存在于內(nèi)質網(wǎng)中，但在細胞膜上也有表達，細胞膜上的GRP78參與細胞信號轉導、抗原提呈及病毒入侵等。有研究證實GRP78是2型登革熱病毒（dengue virus serotype 2）受體復合物的主要成分之一［13］。楊鳳等［14］通過激光共聚焦顯微鏡觀察到GRP78在細胞膜上均勻分布，并指出GRP78可能通過與preS1結合參與HBV早期感染過程，葛以躍等［15］聯(lián)合利用GST Pull-Down與現(xiàn)代蛋白組學技術鑒定了2種與preS1特異結合蛋白：GRP78和GRP75。以上的研究提示，GRP78在HBV感染初期黏附有著非常重要的作用，其在細胞信號轉導、抗原提呈等過程中發(fā)揮重要作用。GRP78能與preS1特異結合并且在肝細胞膜上表達，可能參與HBV早期侵入肝細胞的過程，本研究擬將GRP78作為preS1的候選受體，下一步將對其在HBV早期感染中的作用機制進行研究，為抗病毒藥物的設計與治療方案的更新打下基礎。

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