李勇強(qiáng)，曹永登，侯 宇，李 霞，李曉燕，邵雅華，黃 葳，張 麗，師青春，滕義和

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150001)

骨挫傷和骨折是骨傷科臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病，如何促進(jìn)骨折愈合特別是骨質(zhì)疏松患者的骨質(zhì)愈合一直是骨科研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多從基因水平揭示骨折愈合的作用機(jī)制，BMPs影響骨折愈合是目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。強(qiáng)力接骨膠囊具有活血化瘀、補(bǔ)益肝腎、接骨續(xù)筋的功效，在我院已有20多年臨床應(yīng)用，具有副作用少、療效確切、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，而強(qiáng)力接骨膠囊如何促進(jìn)骨折愈合的現(xiàn)代研究尚屬空白。筆者擬從分子生物學(xué)水平、以骨折端骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)含量的變化作為主要研究?jī)?nèi)容，對(duì)強(qiáng)力接骨膠囊在骨折愈合早中期BMP-2表達(dá)的影響進(jìn)行了探討，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

健康成年新西蘭長(zhǎng)耳大白兔90只，雌雄各半，平均兔齡8.4個(gè)月，平均體質(zhì)量2.3 kg，由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一提供；強(qiáng)力接骨膠囊，由本院(省級(jí)三甲醫(yī)院)制劑室按國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)制成口服膠囊制劑；骨折挫傷膠囊，由哈高科佳木斯中藥有限公司生產(chǎn)；1%BMP第一抗體細(xì)胞抗BMP單克隆抗體工作溶液，由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院病理科提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 把90只兔隨機(jī)分為用藥組、對(duì)照組、空白組，分組后用咬骨鉗在橈骨中下1/3處造成0.4 cm骨缺損的骨折模型，用手術(shù)縫合線仔細(xì)逐層縫合肌肉、皮下組織、皮膚，并用無(wú)菌紗布包扎，不做任何固定。

1.2.2 給藥方法 造模后第2天開(kāi)始用藥組以0.5 g/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)喂服強(qiáng)力接骨膠囊，對(duì)照組以0.3 g/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)喂服骨折挫傷膠囊，空白組喂以白開(kāi)水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由專(zhuān)門(mén)技術(shù)人員在同一實(shí)驗(yàn)條件下統(tǒng)一喂養(yǎng)和管理。

1.3 標(biāo)本取材

將3組分別于骨折后用藥1～5周后，從各組中分別隨機(jī)抽出6只大白兔，通過(guò)耳緣靜脈推入40 ml空氣，利用靜脈空氣栓塞法使其致死。以骨折端為中心取出4.0 cm骨質(zhì)，剔除骨質(zhì)上軟組織及皮膚，保留骨折端上的骨痂，作為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本。

1.4 組織學(xué)標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本用4﹪多聚甲醛溶液浸泡固定，再用EDTA進(jìn)行脫鈣，最后用石蠟包埋并切片。每組切片中隔3張抽1張進(jìn)行蘇木紫-伊紅(HE)染色并進(jìn)行組織學(xué)觀察，余下切片進(jìn)行免疫組化BMP-2染色。

1.5 免疫組化檢測(cè)

按照BMP-2免疫組化試劑盒操作方法，對(duì)切片進(jìn)行免疫組化染色。切片染色后，通過(guò)與計(jì)算機(jī)相連的顯微鏡，在顯微鏡放大400倍的情況下將采集到的免疫組化切片圖像存入計(jì)算機(jī)，并用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析。然后采用彩色分割方法，分割免疫組化切片圖像中BMP-2陽(yáng)性產(chǎn)物區(qū)域，從而求出陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度值和陽(yáng)性平均積分光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察

術(shù)后1周，用藥組在骨折斷端可見(jiàn)大量骨痂生成，骨痂局部可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，以成纖維細(xì)胞為主且分化較成熟，并有少量骨小梁的形成。對(duì)照組骨折斷端可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，但幼稚細(xì)胞多見(jiàn)。空白組骨折斷端成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞數(shù)量最少且排列稀疏?？瞻住?duì)照組均未見(jiàn)骨小梁的形成。

術(shù)后2周，用藥組骨折斷端可見(jiàn)較多的骨小梁形成，并有大量的軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，且軟骨細(xì)胞大多分化成熟，成骨細(xì)胞較大，成纖維細(xì)胞數(shù)量較1周前減少。對(duì)照組可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞，成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞相對(duì)較少，且分化較成熟。空白組成纖維細(xì)胞較多，分化較成熟的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞少見(jiàn)。空白組、對(duì)照組可見(jiàn)骨小梁形成但排列稀疏。

術(shù)后3周，用藥組骨小梁進(jìn)一步增多，排列整齊致密的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞多見(jiàn)，同時(shí)出現(xiàn)少量破骨細(xì)胞。對(duì)照組成骨細(xì)胞數(shù)量增多，成纖維細(xì)胞減少；空白組成纖維細(xì)胞增多。

術(shù)后4周，用藥組可見(jiàn)大量成熟的骨細(xì)胞，并有板層骨、破骨細(xì)胞增多。對(duì)照組可見(jiàn)較多成骨細(xì)胞，并可見(jiàn)少量骨細(xì)胞?？瞻捉M成纖維細(xì)胞減少，可見(jiàn)成骨細(xì)胞，少量骨細(xì)胞。

術(shù)后5周，用藥組可見(jiàn)大量骨小梁形成，骨細(xì)胞排列致密整齊且大都形成橋接，并可見(jiàn)致密性骨皮質(zhì)。對(duì)照組可見(jiàn)大量成骨細(xì)胞、較多骨細(xì)胞、骨小梁增多，大部分未形成橋接，致密性骨皮質(zhì)少見(jiàn)?？瞻捉M成骨細(xì)胞增多，未見(jiàn)橋接形成。

2.2 免疫組化染色觀察

術(shù)后1周，用藥組出現(xiàn)大量的纖維性骨痂，骨痂中有較多的BMP-2強(qiáng)陽(yáng)性染色細(xì)胞。對(duì)照組可見(jiàn)少量纖維性骨痂，空白組未見(jiàn)明顯的纖維性骨痂。成纖維細(xì)胞中對(duì)照組BMP-2呈弱陽(yáng)性表達(dá)，空白組未見(jiàn)明顯染色。

術(shù)后2周，用藥組的成骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、間充質(zhì)細(xì)胞染色明顯增強(qiáng)，BMP-2陽(yáng)性表達(dá)程度強(qiáng)。對(duì)照組成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，但染色明顯淺于用藥組?？瞻捉M亦可見(jiàn)BMP-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但在數(shù)量、著色方面較用藥組更少。

術(shù)后3周，用藥組的BMP-2的陽(yáng)性表達(dá)減弱，對(duì)照組、空白組陽(yáng)性表達(dá)已增強(qiáng)，但三組比較，在表達(dá)上用藥組最強(qiáng)，對(duì)照組次之，空白組最弱。

術(shù)后4周，用藥組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的數(shù)量、范圍減少，且成熟的軟骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯的陽(yáng)性染色，成熟骨細(xì)胞染色淺。對(duì)照組、空白組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增多，范圍加大，但著色較用藥組淺。

術(shù)后5周，用藥組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量、范圍進(jìn)一步減少，成熟骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯染色。對(duì)照組、空白組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)范圍較前增多，軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞可有較淺的染色。

所有切片中骨痂局部BMP-2含量最高，成熟骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯的陽(yáng)性染色。縱向比較，3組術(shù)后陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞BMP-2呈“少→多→少”的含量變化，但用藥組染色高峰出現(xiàn)在術(shù)后2周，對(duì)照組、空白組染色高峰相對(duì)延后，空白組出現(xiàn)最晚。橫向比較，用藥組陽(yáng)性染色最強(qiáng)，對(duì)照組次之，空白組最弱，術(shù)后第1、2周最為明顯。陽(yáng)性產(chǎn)物平均光密度值和陽(yáng)性產(chǎn)物平均積分光密度見(jiàn)表1、2。

表1 不同觀察時(shí)間骨痂中BMP-2表達(dá)光密度均值

注：用藥組與空白組、對(duì)照組比較：*P<0.05

表2 不同觀察時(shí)間骨痂中BMP-2表達(dá)平均積分光密度

注：用藥組與空白組、對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

骨折的愈合是機(jī)體損傷后復(fù)雜的組織學(xué)和生物化學(xué)變化過(guò)程，需要許多不同的細(xì)胞、生長(zhǎng)因子參與修復(fù)，其中BMP-2在骨折愈合過(guò)程中起重要作用。其通過(guò)調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)骨組織，使組織中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞遷徙、增殖、分化，從而調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)骨、軟骨組織形態(tài)形成，分化成為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。侯曉峰等[1]在鹿茸對(duì)實(shí)驗(yàn)型骨折愈合中BMP-2表達(dá)影響的研究中，發(fā)現(xiàn)BMP能刺激間充質(zhì)細(xì)胞的分化，對(duì)干性成骨細(xì)胞及誘導(dǎo)性成骨母細(xì)胞，BMP能刺激其分化成為軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞，從而形成軟骨及骨組織。畢鍇、溫建民等[2]在中醫(yī)骨折三期治療對(duì)家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)對(duì)家兔骨折愈合過(guò)程中BMP-2的免疫組化檢查的圖像分析，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療骨折中能顯著促進(jìn)骨折愈合中BMP-2的表達(dá)。周成洪等[3]在探究接骨3號(hào)方對(duì)

兔撓骨骨折術(shù)后BMP-2表達(dá)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，接骨3號(hào)方在骨折愈合過(guò)程中對(duì)BMP-2的持續(xù)表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用。BMP-2有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力，且已在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[4]。吳劍靜等[5]在仙鹿健骨湯含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)及BMP-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，仙鹿健骨湯含藥血清不僅能促進(jìn)體外培養(yǎng)的新生SD大鼠成骨細(xì)胞礦化功能，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，還能提高新生SD大鼠成骨細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)水平，增加骨細(xì)胞的形成。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，中藥可以促進(jìn)骨折部位骨基質(zhì)鈣鹽沉積，提高骨痂質(zhì)量，促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，可以提高BMP的含量，促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌TGF-β，對(duì)IGF-1的產(chǎn)生有促進(jìn)作用[6～8]。

在本次實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后1周屬于纖維骨痂階段，成纖維細(xì)胞增生活躍。用藥組在術(shù)后1周纖維骨痂大量增生，多于對(duì)照組，遠(yuǎn)多于空白組，局部骨痂BMP-2的陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組和空白組。術(shù)后2～3周，骨折的愈合逐漸由纖維骨痂階段進(jìn)入軟骨成骨階段。此時(shí)間充質(zhì)細(xì)胞大量增殖、分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞功能異?；钴S，BMP-2的含量最多、表達(dá)最強(qiáng)。用藥組BMP-2出現(xiàn)高峰在2周，比對(duì)照組提前1周出現(xiàn)，同時(shí)BMP-2表達(dá)的強(qiáng)度也明顯強(qiáng)于對(duì)照組和空白組。術(shù)后4～5周，骨折愈合開(kāi)始轉(zhuǎn)入骨痂的修復(fù)與塑型階段。成骨細(xì)胞逐漸減少，骨小梁、板層骨不斷構(gòu)建完成，同時(shí)在塑型期破骨細(xì)胞不斷增多，而由于成熟骨細(xì)胞的不斷增多，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)不斷減少，著色較淺。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以看出，用藥組的BMP-2陽(yáng)性表達(dá)程度上較對(duì)照組、空白組強(qiáng)，數(shù)量較對(duì)照組和空白組多，峰值出現(xiàn)的時(shí)間較對(duì)照組、空白組早。由此可推測(cè)，強(qiáng)力接骨膠囊對(duì)BMP-2的合成、分泌有促進(jìn)作用，并影響其分布和改變其表達(dá)時(shí)間與表達(dá)量，從而起到促進(jìn)骨折愈合的作用。

中醫(yī)藥治療骨折依據(jù)整體觀念把“瘀去、新生、骨和”作為理論，把握骨折各期的不同病理特點(diǎn)，結(jié)合骨折各期治則，運(yùn)用中醫(yī)藥理論治療各期病人。強(qiáng)力接骨膠囊根據(jù)以上理論研制而成，經(jīng)過(guò)多年的臨床實(shí)踐探索，方選當(dāng)歸、紅花、續(xù)斷等23味中藥，意在活血化瘀、接骨續(xù)筋、補(bǔ)益肝腎、調(diào)理氣血。強(qiáng)力接骨膠囊在臨床應(yīng)用上已有20多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，療效頗多。但從未在分子生物學(xué)水平上闡述其機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)研究采用對(duì)BMP-2的表達(dá)影響做一定的探索，從分子生物學(xué)水平闡述其對(duì)骨折的影響，但骨折愈合是十分復(fù)雜的過(guò)程，強(qiáng)力接骨膠囊對(duì)BMP-2表達(dá)的影響和確切機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

[1] 侯曉峰，李朝旭，劉景生.鹿茸對(duì)實(shí)驗(yàn)型骨折愈合中BMP-2表達(dá)的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2005, 32 (4): 374-376.

[2] 畢鍇，溫建民，孫永生，等.中醫(yī)骨折三期治療對(duì)家兔骨折愈合中VEGF與BMP-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012,12(18):1344-1347.

[3] 周成洪，龍亨國(guó)，詹旭.接骨3號(hào)方對(duì)兔撓骨骨折術(shù)后BMP-2表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(6):1262-1267.

[4] Chen D, Harris MA.BMP-2 enhances BMP-3，BMP-4 and bone cell differentiation marker genes expression during the induction of mineralizal bone matrix formation incultures of fetal rat calvarial osteoblasts[J]. Calcif Tissue Int,1997,60 (3) :283.

[5] 吳劍靜，康孟樂(lè)，王靖，等.仙鹿健骨湯含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)及BMP-2表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2010，45(2)：103-105.

[6] 李楠.補(bǔ)骨合劑對(duì)種植體-骨結(jié)合界面BMP含量變化的影響[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2001，39(4):17.

[7] 程杰.生骨注射液對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞BMP-2 mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2005, 13(2):203-204.

[8] 侯曉峰,劉景生.中藥促進(jìn)骨折愈合機(jī)理[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2003，1(11)：61-63.