劉寶山，紀超倫，楊向東，苗潤靜，張 蕾，王興麗，馬 霖

(1. 天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300052；2. 天津中醫(yī)藥大學，天津 300193； 3. 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津 300193)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)簡稱再障，是一種可能由不同病因和機制引起的骨髓造血功能衰竭癥。免疫介導的骨髓造血抑制是AA最常見、最重要的發(fā)病機制，是一種自身免疫性疾病[1]。特別是T細胞介導的細胞免疫功能異常參與了再障的發(fā)生與發(fā)展。研究證實，AA患者發(fā)病期間，T淋巴細胞表面的正調(diào)控分子CD28上調(diào)，負調(diào)控共刺激因子CTL相關(guān)抗原-4(CTLA-4)下調(diào)，平衡偏于Th1免疫，T細胞處于“預激活”狀態(tài)[2]。因此，阻斷CD28/mTOR/S6該通路就可能誘導T細胞無能，發(fā)揮免疫抑制作用，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及耐受，恢復再障患者造血功能重建。

薯蕷科植物具有“活血舒筋，消食利水，祛痰，截瘧”的功效[3]。穿龍薯蕷的主要化學成分為甾體皂苷類，主要為薯蕷皂苷(dioscin)、延屬皂苷(trillin),是用于合成多種甾體激素類藥物的薯蕷皂苷元(diosgenin)的重要原料之一，具有調(diào)節(jié)機體免疫的作用。本研究應(yīng)用穿龍薯蕷皂苷治療再生障礙性貧血小鼠，觀察其對T細胞異常激活途徑中p-mTOR、p-S6表達的影響，探討該藥抑制再生障礙性貧血免疫異常的作用機制。

1 材料

1.1 動物與用藥

BALB/c小鼠，雌雄各半，DBA/2小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20 g±2 g)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(檢疫合格號SCXK<京>2009-0004)。穿龍薯蕷皂苷(北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供)，環(huán)孢素軟膠囊(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號100501)，雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，產(chǎn)品批號1007119)。

1.2 試劑與儀器

異丙醇(華北地區(qū)特種試劑開發(fā)中心)，DTT(Sigma分裝)，Go Taq Green Master mix(Promega M7123)，Oligo(dT)18 Primers(TaKaRa D511)，Ribonuclease inhibitor(TaKaRa D2310A)，dNTP Mixture(TaKaRa D4030A)，M-MLV Reverse Transeriptase(Promega M1701)，QuantiTectTM SYBR Green PCR Kit(QIAGEN 204143)，DL2000(TaKaRa)。實時定量PCR儀(杭州博日科技有限公司Linegene9620)，PCR儀(杭州博日科技有限公司TC-96/g/h(b))，去離子水儀(PALL, Purelab Plus，美國)。

2 方法

2.1 再障模型的建立

按姚軍[4]等方法制備免疫介導的再障小鼠模型。

2.1.1 胸腺、淋巴結(jié)懸液的制備 將DBA/2小鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡3 min；無菌取出胸腺及頸部、領(lǐng)下、腋窩等處淋巴結(jié)；加少量生理鹽水，輕輕研磨后過濾，使成單細胞懸液；細胞計數(shù)，將胸腺和淋巴結(jié)細胞按1∶2比例混合；臺盼藍染色鑒定細胞活性，活性細胞應(yīng)達95%以上；計數(shù)并配成所需濃度5×106備用。

2.1.2 制備再障模型小鼠 BALB/c小鼠經(jīng)60Coγ射線計量為6.0 Gy均勻全身照射；于4 h內(nèi)無菌尾靜脈輸入預先取自DBA/2小鼠的胸腺淋巴結(jié)混合細胞，輸入細胞數(shù)為1×106/只。

2.1.3 模型評估 于輸注細胞后第2天小鼠眶叢靜脈取血，枸櫞酸鈉抗凝，全自動生化儀計數(shù)血細胞數(shù)。并取正常BALB/c小鼠作為對照組。取上述小鼠的雙側(cè)尺骨常規(guī)固定，梯度脫水；經(jīng)低溫塑料包埋，室溫下尺骨矢狀面切片(3ūm)，HE-Giemsa染色，鏡下觀察小鼠骨髓組織。根據(jù)血常規(guī)及骨髓象判定成模。

2.2 分組與處理

選取健康BALB/c小鼠140只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機數(shù)字表法選出20只設(shè)為正常對照組，其余分為模型組、西藥對照環(huán)孢素組、中藥對照雷公藤多苷組、中藥治療高劑量組、中藥治療中劑量組、中藥治療低劑量組6組各20只。①正常對照組、模型組灌胃生理鹽水，每次 0.2 ml，每日1次；②西藥對照組：成模后給予環(huán)孢素軟膠囊23.5 mg/kg/d灌胃，每日1次；③中藥對照組：成模后給予雷公藤多苷9.36 mg/kg/d灌胃，每日1次；④低劑量組：成模后給予薯蕷皂苷37.44 mg/kg/d灌胃，每日1次；⑤中劑量組：成模后給予薯蕷皂苷74.88 mg/kg/d灌胃，每日1次；⑥高劑量組：成模后給予薯蕷皂苷149.76 mg/kg/d灌胃，每日1次。各組連續(xù)灌胃14 d，第15天定為取材時間。

2.3 血常規(guī)

分別于造模前、造模后第1天與治療后第15天目內(nèi)眥取血，采用全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)。

2.4 實時熒光定量RT-QPCR檢測再障小鼠p-mTOR/p-S6基因的表達

取組織樣品(大約30～100 mg)用TRIZOL法，提取總RNA。加入核苷酸引物制備cDNA模板。應(yīng)用Real-time PCR Master Mix 的方法進行Real-time PCR，以β-actin作為內(nèi)參對照。mtor上游引物為：5′ AGA ACC AGC CCA TAA GAA AGC 3′；mtor下游引物為：5′ AGA GAA ATC CCG ACC AGT GAG 3′。PS6上游引物為： 5′ CTC TCA GTG AAA GTG CCA ACC 3′；PS6下游引物為： 5′ AGA GAA TTT GAC TGG GCT GAC 3′(引物由上海生物工程有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，QuantiTectTM SYBR Green PCR mix 10 μL, cDNA 2 μL, 上、下游引物各1 μL，蒸餾水6 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性 10 min；94℃變性20 s；59℃退火加延伸20 s，40個循環(huán)；57℃～96℃繪制熔解曲線。應(yīng)用2-ΔΔct(comparative ct method od quantitation, ΔΔCt)法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

2.5 Western Blot法檢測再障小鼠p-mTOR/p-S6蛋白的表達

2.5.1 小鼠骨髓單個核細胞 (BMMNC)分離培養(yǎng) 治療后第15天斷頸處死小鼠，無菌條件下取雙側(cè)股骨，用帶有5號針頭的5 ml注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)液，反復沖洗骨髓腔，將骨髓細胞收集在滅菌離心管內(nèi)并反復吹打，使骨髓細胞充分分散制成懸液。將充分混勻的細胞懸液以1∶1比例加在淋巴細胞分離液的表面，離心2000 r/min，10 min，分離出單個核細胞層，移入5 ml離心管內(nèi)。加入PBS 2 ml反復吹打，離心1000 r/min，10 min，去上清、洗2次。用3 ml1640培養(yǎng)液(青霉素0.0737 g/L，鏈霉素0.1717 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，10%胎牛血清)懸浮沉淀細胞，制成懸液計數(shù)，經(jīng)臺盼藍鑒定細胞活性在95%以上，將懸液移入25 ml培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.5.2 Western Blot法檢測p-mTOR/p-S6蛋白 提取的總蛋白樣品，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合，95℃變性10 min，加至凝膠孔中，進行SDS-PAGE電泳(電壓約8 v/cm)。凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。采用PVDF膜作為固相支持物，用濕轉(zhuǎn)的方式將一抗用封閉液稀釋1000倍；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過夜。TBST 洗滌3次,然后將二抗用1×TBST 稀釋3000 倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中(室溫、避光緩慢搖動)作用60 minTBST洗膜，在暗室中梯度曝光及洗片，使用Image J軟件分析。以β-actin作為內(nèi)參對照，采用美國UVP分析儀器對膠片進行掃描，然后括住每一個條帶，系統(tǒng)自動生成灰度值即為結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠外周血血象比較

表1 穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠外周血血象比較

注：與正常組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較：△P<0.05；與CsA組比較：▲P<0.05；與雷公藤組比較：☆P<0.05

圖1 穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠外周血血象比較

表1圖1顯示，造模后再障模型小鼠的血象(WBC、Hb、PLT)均明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。治療后各治療組小鼠血象均有不同程度上升，與模型組、正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。穿龍薯蕷皂苷低、中、高3組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以中劑量組最優(yōu)。其與兩者陽性藥物對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.2 穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠p-mTOR/p-S6基因表達的影響

表2、3圖2顯示，模型組p-mTOR基因表達顯著上調(diào)，各組均明顯高于正常組(P<0.01)，治療后各組均下調(diào)p-mTOR基因表達，其中中、高劑量組、CsA組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥對照組、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組再障小鼠p-mTOR基因表達比較

注：與正常組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較：△P<0.05；與CsA組比較：▲P<0.05；與雷公藤組比較：☆P<0.05

表3圖2顯示，模型組p-S6基因表達顯著增高，各組均明顯高于正常組(P<0.01)，治療后治療各組均下調(diào)p-S6基因表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，穿龍薯蕷皂苷組以中劑量組療效最好，優(yōu)于中藥對照雷公藤組，次于西藥對照環(huán)孢菌素A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組再障小鼠p-S6基因表達比較

注：與正常組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較：△P<0.05；與CsA組比較：▲P<0.05；與雷公藤組比較：☆P<0.05

圖2 各組再障小鼠p-mTOR、p-S6基因表達比較

3.3 穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠p-mTOR/p-S6蛋白表達的影響

表4圖3、4顯示，模型組p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量顯著增高，各組均明顯高于正常組(P<0.01)，治療后各組p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量均下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，環(huán)孢菌素A組療效最好，穿龍薯蕷皂苷組以中劑量組療效最好，優(yōu)于中藥對照雷公藤組，次于西藥對照環(huán)孢菌素A組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組再障小鼠p-mTOR、p-S6蛋白表達比較

注：與正常組比較：※P<0.05，※※P<0.01；與模型組比較：△P<0.05；與CsA組比較：▲P<0.05；與雷公藤組比較：☆P<0.05

圖3 各組再障小鼠p-mTOR、p-S6灰度值

圖4 各組再障小鼠p-mTOR、p-S6蛋白表達比較

4 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，再障屬于中醫(yī)學“虛勞”、“血證”、“髓枯”等范疇，其病變部位主要在骨髓。中醫(yī)認為其病機以腎虛為本，以熱毒、瘀血、痰濁為標。再障病程遷延難愈，中醫(yī)認為“久病必瘀”，因此補腎填精、活血祛瘀為治療再障的重要原則。西醫(yī)治療以免疫抑制劑為主，并取得了較好療效，目前研究多表明再障是T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Makino，DNM)為薯蕷科植物，其根莖俗稱穿地龍、穿山龍、野山藥，為薯蕷科多年生藤本植物穿山龍薯蕷根莖，產(chǎn)于內(nèi)蒙古、黑龍江等省。其有薯蕷科植物共同的功效，即活血舒筋、消食利水、祛痰截瘧。有研究表明，穿龍薯蕷還有免疫調(diào)節(jié)的作用。宋鴻儒等[5]應(yīng)用血清藥理學方法研究穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖及其分泌IL-2的影響。結(jié)果表明，穿山龍總皂苷含藥血清可抑制因ConA誘導的大鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生IL -2,對IL-4生成的抑制可能是其抑制T淋巴細胞增殖、抑制大鼠細胞免疫功能的途徑之一。舒艷等[6]通過觀察穿山龍水煎劑對小鼠免疫系統(tǒng)的作用，研究發(fā)現(xiàn)其對小鼠的細胞及體液免疫均有抑制。

目前，研究普遍認為再障患者T細胞亞群失調(diào)，CD8+T細胞比例增高且異?；罨細胞活化需要兩種信號，一是TCR與MHC分子-抗原肽復合物特異性結(jié)合，二是協(xié)同共刺激信號，主要來自APC和T細胞表面黏附分子，其中最重要的是T細胞表面的CD28分子，其與相應(yīng)配合CD80及CD86結(jié)合。TCR/CD3復合體可磷酸化CD28尾部的絡(luò)氨酸，活化的CD28能進一步磷酸化PI3K[7]，下游的Akt分子可以通過TSC1/TSC2復合體調(diào)控mTOR的活化。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是存在于胞漿中一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶家族(phosphoinositide kinase -related kinase, PIKK)，mTOR是PI3K/PKB(protein kinase B,PKB)信號通路下游的一個效應(yīng)蛋白。mTOR是一種大分子蛋白質(zhì)，分子量為289kDa，是一類進化上非常保守的蛋白激酶家族，廣泛存在于各種生物細胞中[8]。mTOR在細胞內(nèi)可形成兩種主要不同復合物，即TOR-Raptor和mTOR-Richtor復合物。Raptor與mTOR氨基端結(jié)合，是mTOR調(diào)解蛋白，Raptor可能起支架蛋白作用，把mTOR的激酶TOR信號模體TOS( TOR - signalling motif, TOS)和下游底物70S核糖體6激酶S6K1 (p70S6 kinase protein, S6K1)和4E-BP1 ( 4E-binding protein 1, 4E-BP1 ) 聯(lián)系起來。mTOR下游主要有兩個靶蛋白，即核糖體p70S6 激酶( S6K1)和4E-BP1， 4E-BP1是真核翻譯起始因子( eIF4E)抑制蛋白，eIF4E從磷酸化的4E-BP 釋放后形成活化的eIF4E，促使mRNA翻譯[9]。S6K1在細胞內(nèi)普遍表達是核糖體40S小亞基S6蛋白激酶，其功能主要是使細胞內(nèi)40S核糖體蛋白S6磷酸化，它可促進含有5’末端寡嘧啶區(qū)TOP結(jié)構(gòu)( tract of py-rimidine )mRNA的翻譯，而含有5’TOP結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯的產(chǎn)物主要是核糖體、起始因子和延伸因子等翻譯裝置的必需組分，因此S6K1的激活可促進蛋白質(zhì)的合成以及細胞增殖[10]。研究表明，CD28/PI3K/Akt/mTOR/S6信號通路的過度活化與多種腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Murayama T等[11]實驗發(fā)現(xiàn)，胃癌患者癌細胞p-Akt、p-mTOR表達顯著升高，且與腫瘤發(fā)展情況呈正相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，該信號通路與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，對小鼠應(yīng)用RAPA可抑制其mTOR的活性，并導致胸腺退化，T淋巴細胞的生成受到顯著抑制[12]。張翔等研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞內(nèi)mTOR/S6途徑在正常人和初治SAA患者中靜息，在再障患者中活化[13]。為闡明穿龍薯蕷皂苷治療再障的作用機制，前期工作得出穿龍薯蕷皂苷能夠明顯提高再障小鼠的外周血象，促進造血細胞的恢復的結(jié)論，在此基礎(chǔ)上完成該實驗。

本實驗研究結(jié)果顯示，再障模型組小鼠的p-mTOR、p-S6基因表達顯著上調(diào)，各組均明顯高于正常組，治療后治療各組均下調(diào)，說明再障發(fā)病過程中mTOR/S6基因被異常激活，形成T淋巴細胞高表達，發(fā)生自身免疫反應(yīng)，經(jīng)過治療可下調(diào)mTOR、S6基因的表達。實驗表明，穿龍薯蕷皂苷治療組p-mTOR基因表達與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，其中以中劑量組p-S6基因表達下調(diào)最多，療效最好，優(yōu)于中藥對照雷公藤組，次于西藥對照環(huán)孢菌素A組，差異有統(tǒng)計學意義，說明穿龍薯蕷皂苷對于再障發(fā)病過程中p-mTOR、p-S6基因表達的調(diào)控具有重要意義，療效肯定。再障模型組小鼠的p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量顯著增高，各組均明顯高于正常組，治療后各組p-mTOR、p-S6蛋白相對表達量均下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義。穿龍薯蕷皂苷組以中劑量組療效最好，優(yōu)于中藥對照雷公藤組，次于西藥對照環(huán)孢菌素A組。提示穿龍薯蕷皂苷能夠參與調(diào)節(jié)再障小鼠T淋巴細胞激活過程，對于基于CD28磷酸化途徑的T細胞異常激活反應(yīng)起到一定的抑制作用，抑制p-mTOR、p-S6的表達，阻抑CD28/mTOR/S6/ IFN-γ通路，從而能夠拮抗細胞免疫系統(tǒng)造成的再障小鼠骨髓造血細胞的凋亡，發(fā)揮免疫抑制作用，起到免疫調(diào)節(jié)的功效，改善骨髓造血功能，為穿龍薯蕷皂苷治療再障提供了實驗依據(jù)。而其對T淋巴細胞靶向殺傷骨髓造血細胞保護以及對造血功能重建的影響及其作用機制還有待于進一步研究。

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