王 劍，鄭洪新，劉 研，張錦萍，劉劍輝，宋光熠，劉瑞輝

(1. 遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，沈陽 110101；2.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，沈陽 110101； 3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110847)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal Osteopo-rosis,PMOP)多發(fā)于50～70歲絕經(jīng)后婦女，是以骨量迅速丟失和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性代謝性骨病，骨強(qiáng)度降低、骨折危險性增加，嚴(yán)重威脅絕經(jīng)后婦女的身體健康和生活質(zhì)量[1]。目前PMOP發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，亦無特效防治方法。研究顯示，瘦素(Leptin)可間接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促使其釋放下丘腦源性成骨細(xì)胞抑制因子，作用于骨細(xì)胞而抑制骨形成[2]。臨床實踐表明，中醫(yī)藥防治PMOP具有較為理想的效果，但其療效機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。本研究在中醫(yī)“腎藏精生髓主骨”理論的指導(dǎo)下，以Leptin為效應(yīng)指標(biāo)，探討去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠下丘腦Leptin蛋白水平變化，以及補(bǔ)腎中藥復(fù)方的療效及其調(diào)節(jié)機(jī)制，為中醫(yī)藥防治PMOP提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠共100只，雌性未曾交配，體質(zhì)量(275±25)g，4～5月齡，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供(遼寧省實驗動物質(zhì)量合格證號0004179)。

1.2 藥品

補(bǔ)腎中藥復(fù)方：由鹿茸(脫毛、凍干、粉碎，過80目篩)、淫羊藿(水提、濃縮，上大孔樹脂，乙醇洗脫)、牡蠣(洗凈，曬干，納米技術(shù)粉碎，平均粒徑780 nm)組成。西藥對照：鈣爾奇D(碳酸鈣D3片，Wyeth惠氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10950029，批號1105243)。中藥對照：骨疏康顆粒(方藥組成：淫羊藿、熟地黃、骨碎補(bǔ)、黃芪、丹參、木耳、黃瓜子，遼寧康辰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20003255，批號111103)。

1.3 主要儀器

XR-36型雙能X線骨密度儀(美國NORLAND公司)、電泳儀(BIO-RAD，PowerPac200，美國)、垂直板電泳裝置(BIO-RAD，Mini-Protein III，美國)、Tanon-2500R型全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)等。

1.4 主要試劑

羊抗Leptin多克隆抗體(一抗，美國santa cruz公司)、堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(二抗，北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分組

動物7只用于預(yù)實驗，余者完全隨機(jī)分為6組：正常組(12只)、模型組(12只)、假手術(shù)組(12只)、補(bǔ)腎中藥復(fù)方組(20只)、鈣爾奇D組(18只)、骨疏康組(19只)。

2.2 模型建立及鑒定

2.2.1 骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的建立 正常組除外，其余各組大鼠2%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg體質(zhì)量)麻醉，手術(shù)從腹部切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組只行切口切開而不切除卵巢。

2.2.2 骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的鑒定 目前國內(nèi)外主要是通過檢測骨密度來診斷骨質(zhì)疏松，最常用的檢測方法是雙能X射線吸收測量法(DEXA)。我們應(yīng)用XR-36型雙能X線骨密度儀測定大鼠離體股骨骨密度來鑒定本實驗骨質(zhì)疏松癥大鼠模型復(fù)制是否成功。

2.2.3 給藥劑量與方法 大鼠等效劑量按成人用藥量的6.3倍計算(成人體質(zhì)量按60 kg計算)，給藥容積0.5 ml/100 g體質(zhì)量。正常組、模型組、假手術(shù)組給予等體積的生理鹽水；補(bǔ)腎中藥復(fù)方組(補(bǔ)腎中藥復(fù)方)1.139 g·kg-1·d-1(鹿茸：0.8 g·kg-1·d-1，淫羊藿提取物0.076 g·kg-1·d-1，牡蠣0.263 g·kg-1·d-1)；鈣爾奇D組(鈣爾奇D)0.126 g鈣·kg-1·d-1；骨疏康組(骨疏康顆粒) 2.1 g·kg-1·d-1。術(shù)后7 d開始，每日上午灌胃給藥1次，連續(xù)12周。

2.3 標(biāo)本采集與制備

2.3.1 股骨 取右后肢全股骨剔除肌肉、筋膜(保留骨膜)，生理鹽水沖洗，醫(yī)用紗布包裹，外包錫紙，-20℃冰箱凍存待測骨密度。

2.3.2 下丘腦 無菌取下丘腦，一半置于高壓滅菌的空白EP管內(nèi)，-70℃冰箱凍存，待做Western Blot。

2.4 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.4.1 雙能X線骨密度儀檢測離體股骨骨密度(BMD) 應(yīng)用XR-36型雙能X線骨密度儀進(jìn)行大鼠離體股骨骨密度檢測，應(yīng)用儀器附帶的“the Small Subject Scout Scan”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。骨密度采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量表示(g/cm2)。

2.4.2 Western Blot檢測下丘腦Leptin蛋白水平 細(xì)胞裂解法提取大鼠下丘腦總蛋白，Lowry法蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印，一抗、二抗孵育，酶顯法顯色。Tanon-2500R型全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，Scion Image軟件分析蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/ GAPDH條帶灰度值來表示目標(biāo)蛋白(Leptin)的相對水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組離體股骨骨密度比較

表1顯示，灌胃過程中動物死亡5只，取材時共計88只。離體股骨骨密度檢測統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常組比較模型組明顯降低(P<0.001)；與模型組比較，補(bǔ)腎中藥復(fù)方組、骨疏康組明顯升高(P<0.05)，鈣爾奇D組雖有升高趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組下丘腦Leptin蛋白水平比較

圖1表2顯示，下丘腦Leptin蛋白水平檢測統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，補(bǔ)腎中藥復(fù)方組明顯降低(P<0.05)，鈣爾奇D組、骨疏康組雖有降低趨勢但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠離體股骨骨密度

注：與正常組比較：***P<0.001；與模型組比較：△P<0.05

圖1 下丘腦Leptin、GAPDH蛋白Western Blot條帶注：A組：正常組；B組：模型組；C組：假手術(shù)組；D組： 補(bǔ)腎中藥復(fù)方組；E組：鈣爾奇D組；F組：骨疏康組

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

PMOP患者骨密度降低導(dǎo)致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折，嚴(yán)重威脅絕經(jīng)后婦女的身體健康和生活質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制和防治研究已成為婦女保健的重要課題。

中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏精生髓主骨?！薄端貑枴ど瞎盘煺嬲摗罚骸芭悠邭q，腎氣盛，齒更發(fā)長……四七筋骨堅，發(fā)長極，身體盛壯……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”，說明女子盛年之前，隨年齡增長，腎中精氣逐漸充盛、生髓養(yǎng)骨，骨逐漸強(qiáng)勁有力；盛年之后，隨年齡增長，腎中精氣逐漸衰減、髓減骨枯，骨逐漸痿弱無力，七七腎虛天癸竭，地道不通而絕經(jīng)，腎虛精虧，骨髓生化乏源，骨失之滋養(yǎng)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。因此，PMOP的根本病機(jī)是腎虛，臨床防治該病可選用補(bǔ)腎法。

瘦素(Leptin)由肥胖基因編碼，白色脂肪細(xì)胞合成、分泌，是一種具有146個氨基酸的多肽類激素，其在骨代謝研究領(lǐng)域的作用正逐漸被重視[3、4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Leptin在中樞對骨代謝表現(xiàn)為負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可間接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促使其釋放下丘腦源性成骨細(xì)胞抑制因子，作用于骨細(xì)胞而抑制骨形成[2]。Wong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Leptin作用于下丘腦弓狀核神經(jīng)元細(xì)胞，降低神經(jīng)肽Y mRNA的轉(zhuǎn)錄，通過成骨細(xì)胞上的神經(jīng)肽Y受體抑制成骨細(xì)胞分化，降低骨密度。

關(guān)于下丘腦Leptin蛋白水平與PMOP發(fā)病機(jī)制的關(guān)系以及中藥的相應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，筆者尚未見到國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。采用雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除方法進(jìn)行造模，是研究PMOP的經(jīng)典模型[6]。本研究選用筆者導(dǎo)師鄭洪新教授多年科研、臨床實踐的補(bǔ)腎中藥復(fù)方(由“生精補(bǔ)髓、強(qiáng)筋健骨”之經(jīng)典補(bǔ)腎中藥鹿茸、補(bǔ)腎強(qiáng)筋健骨之傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥淫羊藿和補(bǔ)腎壯骨、滋陰潛陽之牡蠣組成，全方共奏補(bǔ)腎填精、益髓壯骨之功)作為實驗因素，選用鈣爾奇D(促進(jìn)鈣、磷在腸內(nèi)的吸收，并促進(jìn)骨骼的正常鈣化)作為西藥對照，選用首個治療骨質(zhì)疏松癥的中藥復(fù)方——骨疏康顆粒(補(bǔ)腎益氣、活血壯骨)作為中藥對照，以下丘腦Leptin蛋白水平作為效應(yīng)指標(biāo)，探討PMOP的發(fā)病機(jī)制以及補(bǔ)腎中藥復(fù)方的療效機(jī)理。結(jié)果顯示，模型組大鼠骨密度比正常組明顯降低，說明本實驗切除雙側(cè)卵巢復(fù)制PMOP大鼠模型成功。模型組大鼠下丘腦Leptin蛋白水平比正常組明顯升高，負(fù)性調(diào)節(jié)骨代謝，抑制骨形成，降低骨密度。補(bǔ)腎中藥復(fù)方明顯降低模型大鼠下丘腦Leptin蛋白水平，增強(qiáng)骨形成，從而明顯升高模型大鼠的骨密度，療效顯著，優(yōu)于骨疏康顆粒。鈣爾奇D雖可降低模型大鼠下丘腦Leptin蛋白水平，升高其骨密度，但均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，下丘腦Leptin蛋白水平升高可能是PMOP的發(fā)病機(jī)制之一；應(yīng)用補(bǔ)腎中藥復(fù)方，可明顯降低下丘腦Leptin蛋白水平，對該病具有顯著的防治效果，療效優(yōu)于骨疏康顆粒及鈣爾奇D，故臨床防治PMOP可選用補(bǔ)腎法。

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