胡學(xué)超，張 麗，任路靜，紀(jì)曉俊，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800)

菌種保藏方法對(duì)裂殖壺菌生長(zhǎng)及發(fā)酵性能的影響

胡學(xué)超，張 麗，任路靜，紀(jì)曉俊，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800)

考察保護(hù)劑、保藏溫度及預(yù)冷凍方法對(duì)Schizochytriumsp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能保持的影響。結(jié)果顯示：在-80 ℃低溫保藏6個(gè)月后，滲透性保護(hù)劑的細(xì)胞存活率均比非滲透性保護(hù)劑高了5%，其中用60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻糖的保護(hù)劑最終的株細(xì)胞存活率達(dá)到80.02%，明顯優(yōu)于其他保護(hù)劑。采用液氮-196 ℃保藏菌種(兩步預(yù)冷凍法、60%海藻糖保護(hù)劑)，存儲(chǔ)6個(gè)月后存活率高達(dá)90.70%，生物量、油產(chǎn)量和二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量分別達(dá)到了61.65、26.41和11.10 g/L，為最優(yōu)的保藏方法，為裂殖壺菌的實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種長(zhǎng)期安全的保藏法。

裂殖壺菌；DHA；菌種保藏；保護(hù)劑

二十二碳六烯酸(C22:6,DHA)是一種重要的ω-3型長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，在促進(jìn)腦細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、提高視力以及預(yù)防心腦血管疾病等方面具有顯著功效[1-2]，被科學(xué)家譽(yù)為“腦黃金”。迄今為止，DHA生產(chǎn)菌主要為破囊壺菌、裂殖壺菌等海生真菌和海生異養(yǎng)微藻。其中，裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)屬于真菌門(mén)(Eumycoat)、卵菌綱(Oomycetes)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae),其具有生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和DHA含量高等優(yōu)勢(shì)，已被證實(shí)為理想的DHA生產(chǎn)菌株[3]。

菌種保藏是微生物研究中的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，對(duì)于微生物發(fā)酵的科研和生產(chǎn)，菌種具有優(yōu)良的發(fā)酵性能是至關(guān)重要的。目前，微生物培養(yǎng)過(guò)程中避免不了頻繁的連續(xù)傳代，有些特殊的菌種更需要間斷性的活化培養(yǎng)來(lái)維持其細(xì)胞生物活性。但這種頻繁的接種，不僅會(huì)增加菌種被污染的可能性，而且大大提高菌種基因突變[4]。因此，選擇一種較持久并能最大限度保持細(xì)胞特性，并降低甚至阻斷這種遺傳漂變的保藏方法顯得尤為重要。現(xiàn)在微生物保藏的方法主要有傳代法、干燥法、冷凍法及冷凍干燥法，其中后兩者是應(yīng)用最廣也是最長(zhǎng)期安全的方法。Samuele等[5]探究了白腐真菌低溫甘油管保藏、低壓冷凍保藏和液氮保藏法3種保藏法對(duì)菌種性能的影響，結(jié)果證明前兩者的保藏方法更適合白腐真菌的保藏。馬學(xué)斌等[6]探討了不同保藏方法對(duì)海洋細(xì)菌的長(zhǎng)期保存效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%脫脂乳和 35%甘油肉湯對(duì)海洋細(xì)菌的長(zhǎng)期保存效果較好。

本文將主要從保藏溫度、保護(hù)劑類(lèi)型和預(yù)冷凍方法3個(gè)方面，詳細(xì)探討不同的冷凍保藏方法對(duì)Schizochytriumsp.HX-308存活率和發(fā)酵參數(shù)的影響，并從理論上解釋這些因素對(duì)細(xì)胞保藏過(guò)程中的作用，為尋求一種最佳的保藏方法以減緩Schizochytriumsp.HX-308菌種的退化速度提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種

裂殖壺菌Schizochytriumsp.HX-308，筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào)CCTCC M 209059)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 15、MgSO4·7H2O 5、KCl 2、CaCl21、NaHCO30.5、KH2PO44、酵母膏 2、谷氨酸鈉10、葡萄糖 40。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：Na2SO415、MgSO4·7H2O 5、KCl 2、(NH4)2SO42、KH2PO44、酵母膏 2、谷氨酸鈉10、葡萄糖 100。

以上培養(yǎng)基都在121 ℃、30 min條件下滅菌，并以體積分?jǐn)?shù)為0.2%的量向培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量濃度為50、50和0.25 mg/mL的維生素B1、B6和B12母液，終質(zhì)量濃度分別為 0.1、0.1 mg/mL和0.5 μg/mL。

1.3 培養(yǎng)方法

種子和發(fā)酵培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[7]。

1)不同保護(hù)劑的考察 將活化好的菌株與配制好的不同保護(hù)劑按體積比1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中，混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱中保藏。

2)不同保藏溫度的考察 將活化好的菌株與40%甘油保護(hù)劑按1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中，混勻后置于-80 ℃超低溫冰箱和-196 ℃液氮中保藏。

3)-196 ℃液氮保藏法的優(yōu)化 將活化好的菌株與保護(hù)劑按1∶ 1的比例加入到菌株保藏管中混勻。一組直接置于-196 ℃液氮中保藏；另一組先于4 ℃冰箱中存放30 min,再將保藏管放入-80 ℃冰箱中存放12 h，最后將凍存管投入-196 ℃液氮中保藏。

1.4 分析方法

發(fā)酵液中葡萄糖和谷氨酸鈉濃度采用SBA-40C型生物傳感儀(山東省科學(xué)院生物研究所)進(jìn)行分析檢測(cè)。細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)定和油脂提取方法參照文獻(xiàn)[8]；脂肪酸甲酯制備及氣相色譜分析方法參照文獻(xiàn)[9]。

細(xì)胞存活率測(cè)定參照文獻(xiàn)[5]，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行。具體方法為吸取50 μL細(xì)胞懸液到EP管內(nèi)，加入臺(tái)盼藍(lán)染色液50 μL，輕輕吹打混勻，3～5 min(染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng))后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 -80 ℃超低溫保藏下保護(hù)劑對(duì)Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率的影響

在菌種保藏過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑起到保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的重要作用。它可以改變細(xì)胞周?chē)奈锢怼⒒瘜W(xué)環(huán)境，減少不必要的力學(xué)損傷，從而最大限度地保持細(xì)胞的生理和生物活性[10]。冷凍保護(hù)劑按其對(duì)細(xì)胞作用的部位，可以分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑。滲透性保護(hù)劑一般都是一些小分子物質(zhì)，如甘油、二甲基亞砜(DMSO)、單糖、二糖和氨基酸等，它們可以滲透到細(xì)胞內(nèi)部；非滲透性保護(hù)劑一般是一些大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多聚糖和聚乙二醇等，它們不能滲透到細(xì)胞內(nèi)部，只能作用于細(xì)胞表面[11]。

根據(jù)Schizochytriumsp.HX-308菌種的細(xì)胞特性，筆者選取了這兩類(lèi)保護(hù)劑中幾種代表性的保護(hù)劑，探討這些保護(hù)劑及其不同濃度對(duì)菌種的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出：保藏1個(gè)月后，滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑的菌種平均存活率分別為92.48%和89.69%；保藏6個(gè)月后，滲透性保護(hù)劑的菌種平均存活率在75%，而非滲透性保護(hù)劑的菌種平均存活率僅為70%，而且前者的存活率下降速率比后者高了2.02%。由此可以發(fā)現(xiàn)，在-80 ℃超低溫保藏下，滲透性保護(hù)劑的保持效果較優(yōu)于非滲透性保護(hù)劑。這主要是因?yàn)?，滲透性保護(hù)劑含有較多的羥基，不僅能與細(xì)胞表面的自由基結(jié)合，形成保護(hù)層，還能滲透到細(xì)胞內(nèi)部結(jié)合自由水，減少了冰晶形成，從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)部起到保護(hù)作用，降低了力學(xué)損傷對(duì)細(xì)胞造成的破壞[12]。

在2種滲透性保護(hù)劑中，40%(體積分?jǐn)?shù))甘油和60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))海藻糖的保藏效果為較佳。6個(gè)月后菌種存活率最高，分別為75.26%和80.02%；存活率下降比率也最慢，分別僅為4.12%和3.33%。在2種非滲透性保護(hù)劑中，30%(體積分?jǐn)?shù))聚乙二醇20 000的保藏效果較佳，6個(gè)月后菌種存活率和存活率下降比率分別為72.23%和4.63%。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60%海藻糖的保藏效果最佳。這主要是因?yàn)?，海藻糖屬于半滲透性保護(hù)劑，只能滲透到細(xì)胞壁，胞內(nèi)的水形成部分冰晶，使保護(hù)劑的局部濃度增大，從而提高了保護(hù)劑玻璃化的溫度，這樣保藏環(huán)境就較容易達(dá)到玻璃化狀態(tài)，而玻璃化狀態(tài)是最穩(wěn)定的狀態(tài)，能很好地保護(hù)細(xì)胞，保持其生理生化活性[13]。

表1 保護(hù)劑對(duì)Schizochytrium sp.HX-308存活率的影響

2.2 保藏溫度對(duì)Schizochytrium sp.HX-308菌種性能的影響

細(xì)胞保藏在某些低溫環(huán)境下，其細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)可被減緩甚至停止，從而能長(zhǎng)期保持其活性，但在復(fù)蘇后仍能恢復(fù)其正常生理功能。筆者選取了低溫為-20 ℃、-80 ℃和液氮-196 ℃，探討保藏6個(gè)月后，菌種存活率及發(fā)酵性能的差異，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出：保藏6個(gè)月后，-80 ℃保藏的菌種的存活率最高達(dá)到75.26%，同時(shí)相應(yīng)的存活率下降比率也最低為4.12%?？墒?，筆者也發(fā)現(xiàn)一個(gè)不尋常的現(xiàn)象，液氮-196 ℃保藏的菌種，在這6個(gè)月的保藏中，存活率呈直線下降趨勢(shì)，到6個(gè)月后，菌種基本全部死亡。

不同保藏溫度對(duì)Schizochytriumsp.HX-308菌種發(fā)酵性能的影響如圖1所示。由圖1可知：保藏6個(gè)月后，-80 ℃保藏的菌種的發(fā)酵生物量、DHA產(chǎn)量稍高于-20 ℃，分別達(dá)到了50.91和10.70 g/L。同樣也發(fā)現(xiàn)，液氮-196 ℃保藏的菌種在6個(gè)月后，菌種的基本發(fā)酵性能也基本退化，無(wú)法進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。

王華等[14]研究發(fā)現(xiàn)，液氮-196 ℃保藏是目前微生物保藏中公認(rèn)的最安全、最有效的長(zhǎng)期保藏方法。但在本試驗(yàn)中，液氮-196 ℃保藏菌種基本都死亡了，有悖于常理。這可能是因?yàn)椋谝旱?196 ℃保藏的處理方法是將菌種和保護(hù)劑直接投入液氮中保藏，這將使細(xì)胞瞬間處于一個(gè)極低的環(huán)境，并且這種冷凍速率隨機(jī)性大、不穩(wěn)定，這就一方面導(dǎo)致胞外的水分大量結(jié)冰，胞內(nèi)水分外滲，細(xì)胞皺縮變形；另一方面，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的自由水瞬間形成大量的冰晶，這些冰晶極大地破壞了細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)合這兩方面的原因，導(dǎo)致了對(duì)細(xì)胞形成了致命性的力學(xué)損傷[15-17]。

表2 保藏溫度對(duì)Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率的影響

圖1 保藏溫度對(duì)Schizochytrium sp.HX-308菌種發(fā)酵性能的影響Fig.1 Effects of preservation temperature on fermentation performance of Schizochytrium sp.HX-308

2.3 液氮-196 ℃保藏法的優(yōu)化研究

基于2.2中液氮-196 ℃保藏法菌種全部死亡的現(xiàn)象，因此有必要對(duì)液氮保藏進(jìn)行優(yōu)化。一方面，采用分步預(yù)冷凍法：先將裝有按一定比例混合的菌種和保護(hù)劑的保藏管置于4 ℃預(yù)冷凍30 min，再將保藏管置于-80 ℃預(yù)冷凍12 h，最后將保藏管投入液氮-196 ℃中長(zhǎng)期保藏。另一方面，優(yōu)化保護(hù)劑：根據(jù)2.1中的結(jié)果，分別選取保藏效果較佳的一個(gè)滲透性保護(hù)劑海藻糖和非滲透性保護(hù)劑PEG20000以及兩者混合的混合保護(hù)劑。

6個(gè)月后，菌種存活率及發(fā)酵性能結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：采用兩步預(yù)冷凍法后，菌種的存活率明顯提高，6個(gè)月后存活率基本上都在75%以上，其中60%海藻糖保藏的菌種存活率最高，達(dá)到了90.70%，平均比其余3種保護(hù)劑高了13.06%，其平均存活率下降比率也最低，僅為1.67%；同時(shí)60%海藻糖的菌種的最終發(fā)酵指標(biāo)生物量、油產(chǎn)量和DHA含量較其他保護(hù)劑也稍高，分別為61.65、26.41和11.10 g/L。因此，在液氮-196 ℃中，采用60%海藻糖作為保護(hù)劑的兩步預(yù)冷凍法，保藏效果較好，為裂殖壺菌的實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種長(zhǎng)期安全的保藏法。

圖2 保護(hù)劑對(duì)Schizochytrium sp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能的影響Fig.2 Effects of protectants on survival rate and fermentation performance of Schizochytrium sp.HX-308

3 結(jié) 論

考察了不同保護(hù)劑、不同保藏溫度及不同預(yù)冷凍方法對(duì)Schizochytriumsp.HX-308菌種存活率及發(fā)酵性能保持的影響。在-80 ℃低溫保藏下，不同保護(hù)劑對(duì)Schizochytriumsp.HX-308菌種保藏效果存在著明顯的差異。滲透性保護(hù)劑的細(xì)胞存活率比非滲透性保護(hù)劑高5%，其中60%海藻糖最終的菌種存活率達(dá)到了80.02%，明顯優(yōu)于其他保護(hù)劑。采用60%海藻糖為保護(hù)劑，結(jié)合兩步預(yù)冷凍法，菌種在液氮-196 ℃環(huán)境下保藏6個(gè)月后存活率可達(dá)到90.70%，生物量、油產(chǎn)量和DHA產(chǎn)量無(wú)明顯改變，分別達(dá)到了61.65、26.41和11.10 g/L。本文提出一種適于裂殖壺菌的-196 ℃液氮保藏法，為長(zhǎng)期保藏Schizochytriumsp.菌種并降低其優(yōu)良發(fā)酵性能的退化提供了技術(shù)指導(dǎo)。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Effects of different strain preservation methods on cell growth andfermentation performance of Schizochytrium sp.

HU Xuechao,ZHANG Li,REN Lujing,JI Xiaojun,HUANG He

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

The effects of cryoprotectants,preservation temperature and different pre-freezing methods on the survival and the fermentation ofSchizochytriumsp.HX-308 were investigated.Results of different cryoprotectants showed that cell survival rate when using permeable protective agent was 5% higher than that of unpermeable protective agent after preserved 6 months at -80 ℃. Highest cell survival rate of 80.02% was obtained when using 60% trehalose. In addition,further increase of cell survival rate up to 90.70% was obtained when using a two-step pre-freezing method and 60% trehalose as the cryopretectant after 6 months at -196 ℃.Cell dry weight,lipid yield and docosahexaenoic acid(DHA) content reached 61.65 g/L,26.41 g/L and 11.10 g/L,respectively.This preservation method was proved to be the best method and could be used as a long period and safe method for the laboratory research and industrial production ofSchizochytriumsp.

Schizochytriumsp.;docosahexaenoic acid;strain culture;cryoprotectants

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.003

2013-07-19

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA021704)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAD23B03)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012424)

胡學(xué)超(1983—)，男，湖北荊州人，碩士研究生，研究方向：化學(xué)工程；任路靜(聯(lián)系人)，講師，E-mail:renlujing@njtech.edu.cn

Q815

A

1672-3678(2014)06-0013-05