張洪濤，范尊曉，朱 莉，趙小亮，詹曉北,*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

α-1,3-葡聚糖的精制、鑒定及其系列寡糖的制備與序列表征

張洪濤1，范尊曉1，朱 莉2，趙小亮3，詹曉北1,*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003）

目的：提取α-1,3-葡聚糖并獲得系列α-1,3-葡聚寡糖。方法：以香菇子實(shí)體粗提粉為原材料，依次經(jīng)生理鹽水（0.9% NaCl）和水溶解提取，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaOH和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% NaBH4溶解，調(diào)節(jié)pH值至中性再分離提取的分級(jí)沉淀策略，獲得了依次命名為LFⅠ、LFⅡ、LFⅣ、PⅢ和PⅣ的5個(gè)不同組分，再利用紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對(duì)PⅣ結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，然后利用酸解法對(duì)PⅣ進(jìn)行寡聚化，并利用常壓色譜Bio-Gel P4柱進(jìn)行分離，同時(shí)對(duì)每個(gè)組分利用基質(zhì)輔助激光解吸-電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS）或電噴霧離子化質(zhì)譜法（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）進(jìn)行表征。結(jié)果：結(jié)構(gòu)分析表明PⅣ為線性α-1,3-葡聚糖，10 mmol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）中，100 ℃處理2 h為較佳的水解條件，經(jīng)過Bio-Gel P4柱分離獲得的各個(gè)組分被依次鑒定為α-1,3-2～α-1,3-13糖。結(jié)論：實(shí)現(xiàn)α-1,3-葡聚糖的分級(jí)精制與結(jié)構(gòu)鑒定，成功獲得結(jié)構(gòu)確定的系列α-1,3-葡聚寡糖。

α-1,3-葡聚糖；結(jié)構(gòu)鑒定；核磁共振；α-1,3-葡聚寡糖；基質(zhì)輔助激光解吸-電離質(zhì)譜

α-1,3-葡聚糖是存在于多種微生物細(xì)胞壁的多糖[1-3]，一方面其衍生物具有抗腫瘤等生物活性[4]，另一方面在致病菌入侵機(jī)體過程中具有重要作用，如α-1,3-葡聚糖通過阻斷Dectin-1識(shí)別致病菌，加速了致病菌入侵機(jī)體[5]；同樣α-1,3-葡聚糖促進(jìn)了致病菌侵入稻谷植株，含有α-1,3-葡聚糖水解酶的轉(zhuǎn)基因稻谷能明顯增強(qiáng)其對(duì)Magnaporthe oryzae的抗性[6]。此外，α-1,3-葡聚糖誘導(dǎo)曲霉菌的分生孢子聚合[7]。在加強(qiáng)功能因子的構(gòu)效、量效關(guān)系及其作用機(jī)理的研究已經(jīng)成為尋找與發(fā)現(xiàn)新型功能糖的主流趨勢(shì)下，如何探尋α-1,3-葡聚糖的功效機(jī)制成為成功對(duì)α-1,3-葡聚糖進(jìn)行“構(gòu)-效”關(guān)系研究的核心。

多糖在生物體內(nèi)的活性體現(xiàn)在與功能蛋白受體相互識(shí)別、相互作用的過程中[8-9]，多糖通過與功能靶標(biāo)蛋白結(jié)合來激活機(jī)體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞信號(hào)途徑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其功能。因此篩選獲得能夠識(shí)別α-1,3-葡聚糖的功能蛋白成為闡明α-1,3-葡聚糖功效機(jī)制的關(guān)鍵。

根據(jù)蛋白序列、識(shí)別糖鏈的特異性以及結(jié)構(gòu)的不同，目前將糖-蛋白識(shí)別模型（carbohydrate-binding modules，CBMs）歸為69 個(gè)不同類型（www.cazy. org）。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的相似性又將CBMs分為3 個(gè)大類型：1）A-型（表面識(shí)別類型），糖鏈主要與靶標(biāo)CBMs蛋白的表面部位識(shí)別；2）B-型（糖鏈識(shí)別型），該型CBMs主要通過與聚合度大于3的寡糖識(shí)別；3）C-型（小糖識(shí)別類型），該類型CBMs主要與低聚合度的寡糖進(jìn)行識(shí)別[10]。這表明：糖鏈與靶標(biāo)蛋白受體結(jié)合時(shí)，主要是通過糖鏈中的活性中心——寡糖片段與受體蛋白真正相結(jié)合[11]。因此，從多糖的活性中心——寡糖的角度篩選功能蛋白成為一條有效的捷徑。

由于沒有商業(yè)化的α-1,3-葡聚糖或α-1,3-葡聚寡糖可以購買，本研究根據(jù)香菇中可以提取α-1,3-葡聚糖的報(bào)道[12]，主要關(guān)注于：1）首先利用香菇子實(shí)體粗提多糖進(jìn)行分級(jí)提取獲得α-1,3-葡聚糖并利用紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）對(duì)提取的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定與驗(yàn)證；2）利用酸解技術(shù)對(duì)獲得的α-1,3-葡聚糖進(jìn)行寡聚化并進(jìn)行凝膠色譜分離，同時(shí)對(duì)獲得組分進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸-電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS）分析，最終獲得了聚合度從α-1,3-2～α-1,3-13糖的系列寡糖。本研究為進(jìn)一步基于糖芯片技術(shù)篩選獲得能夠識(shí)別α-1,3-葡聚寡糖的功能蛋白配體奠定了寡糖資源物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇子實(shí)體粗提多糖粉 杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司；Dextran多糖水解混合物 Imperial College London；高效薄層層析（high performance thin layer chromatography，HPTLC）板 德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet Nexus 470 FT-IR紅外光譜儀 美國Nicolet公司；Micromass Q-Tof Mass Spectrometer 英國Waters公司；Micromass Tof Spec 2E-TOF 英國Waters公司；JNM-ECP600核磁共振波譜儀 日本理光公司；ICS-5000離子色譜儀（脈沖安培檢測器） 美國Dionex公司。

1.3 方法

1.3.1 α-1,3-葡聚糖的分級(jí)拆分

α-1,3-葡聚糖的提取參照Zhang Pingyi等[12]的方法。香菇子實(shí)體粗提多糖粉依次經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%NaCl、水、5%NaOH/0.05%NaBH4溶解、調(diào)節(jié)pH值至中性后得到上清液LFⅠ、LFⅡ、LFⅢ和沉淀PⅢ、PⅣ，具體流程見圖1。

圖1 1α-1,3-葡聚糖的提取流程Fig.1 Flowchart for the extraction of α-1,3-glucan from shiitake

1.3.2 PⅣ多糖的單糖組成分析

精確稱取0.100 0 g葡萄糖、木糖、巖藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖，分別以體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈-水溶液定容至10 mL。再分別移取1.00 mL置于同一容量瓶中，搖勻，定容至10 mL，得到單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用熱凝膠多糖（β-1,3-glucan，單糖組成僅為葡萄糖）作為對(duì)照，稱取熱凝膠和PⅣ多糖各15 mg，分別加入2 mol/L CF3COOH 2 mL，封管后在100 ℃下反應(yīng)8 h，水解產(chǎn)物加入甲醇，用氮吹儀吹干，反復(fù)3 次（用于除去CF3COOH）。然后用ICS-5000離子色譜儀進(jìn)行色譜分析。采用CarboPac PA20（3 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，梯度洗脫，流動(dòng)相：A去離子水，B 250 mmol/L NaOH，C 1 mol/L CH3COONa，0～21 min：V（A）∶V（B）∶V（C）=97.4∶2.6∶0；21～21.1 min：V（A）∶V（B）∶V（C）=92.4∶2.6∶5.0；21.1～30 min：V（A）∶V（B）∶V（C）=77.4∶2.6∶20；30～30.1 min：V（A）∶V（B）∶V（C）=20∶80∶0；30～50 min：V（A）∶V（B）∶V（C）=20∶80∶0。流速為0.5 mL/min。

1.3.3 多糖PⅣ的紅外光譜分析

采用KBr圓盤法處理[13]：在紅外燈照射下，取少許多糖和3～4 勺KBr（多糖-KBr質(zhì)量比約為1∶50）于研缽中研細(xì)，取適量壓成透光薄片上樣，使用Nicolet Nexus 470 FT-IR紅外光譜儀在4 000～500 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行檢測分析。

1.3.4 多糖PⅣ的核磁共振分析

NMR分析樣品準(zhǔn)備[14]：將50 mg多糖PⅣ在P2O5真空干燥箱中充分干燥后溶解于0.5 mL D2O中，真空冷凍干燥，重復(fù)3 次，最后將樣品用0.5 mL D2O溶解轉(zhuǎn)移至核磁管中，丙酮作為內(nèi)參，在25 ℃下進(jìn)行一維1H-NMR分析，采用MestReNova軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輔助解析。

1.3.5 α-1,3-葡聚糖（多糖PⅣ）水解與常壓色譜分離

Dextran水解產(chǎn)物用Bio-Gel P4（1.6 cm×90 cm，90～180 μm）凝膠柱子進(jìn)行凝膠色譜分離，用于評(píng)估Bio-Gel P4柱子的分離效果。α-1,3-葡聚糖在10 mmol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）中（按照1 mg多糖∶200 μL 10 mmol/L TFA）100 ℃處理2 h，取出后立即放置冰上，等待降為室溫后，加入2 mL的甲醇，用氮?dú)獯蹈?，反?fù)3 次用于除去TFA。定容于1 mL的水中，用Bio-Gel P4凝膠柱進(jìn)行色譜分離。

對(duì)于分離峰形獨(dú)立良好的寡糖組分，根據(jù)出峰時(shí)間與峰形直接歸類收集，對(duì)于分離效果不是很理想的大片段寡糖，先用MALDI-MS分析分子質(zhì)量，然后再進(jìn)行歸類收集。獲得的從2糖到13糖組分分別單獨(dú)收集并冷凍干燥，對(duì)每一組分，分別取出約2 μg寡糖用HPTLC板來進(jìn)行分析，展開劑采用正丙醇-水（8∶3，V/V）。Orcinal做染色劑，在105 ℃下處理90 s用于顯色[15]。

1.3.6 寡糖序列質(zhì)譜表征

寡糖分子質(zhì)量分析[16]：ESI-MS主要用于小分子物質(zhì)的分析，用ESI-MS分析大分子質(zhì)量的寡糖時(shí)，則會(huì)使其裂解成大量的碎片，無法獲得大分子寡糖的分子質(zhì)量，而MALDI-MS則不會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，因而可以用于大分子寡糖的分析，由于MALDI-MS需要基質(zhì)輔助才能完成分子質(zhì)量的分析，基質(zhì)分子質(zhì)量較小，小分子質(zhì)量寡糖用MALDI-MS進(jìn)行分析時(shí)則很容易被基質(zhì)峰掩蓋掉。因此，在本實(shí)驗(yàn)對(duì)于聚合度低于4的寡糖，用負(fù)離子ESI-MS方法測定寡糖分子質(zhì)量，儀器為Micromass Q-Tof Mass Spectrometer，氮?dú)庾鳛槿ト軇┗挽F化氣體，流速分別為250 L/h和15 L/h。源溫度為80 ℃，去溶劑溫度為150 ℃。毛細(xì)管電壓為3 kV，寡糖溶解在甲醇-水（1∶1，V/V）溶液中，寡糖濃度為5～10 pmol/μL，每次取5 μL注射入進(jìn)樣口用于分析，乙腈：1 mmol/L碳酸氫銨（1∶1，V/V）作為流動(dòng)相，由注射器進(jìn)樣泵控制流速為10 μL/min，主要產(chǎn)生[M-H]－的離子碎片峰。對(duì)于聚合度高于4的寡糖，其分子質(zhì)量用Waters的Micromass Tof Spec 2E-TOF儀器進(jìn)行表征，寡糖首先溶解于水中，濃度為10～20 pmol/μL，取0.25 μL樣品和2-（4-羥基苯唑）苯甲酸一起加到樣品板上，室溫下等樣品板上的液體全部揮發(fā)后，樣品和助劑的混合物用乙醇重新結(jié)晶。對(duì)于中性糖，MLADI源主要產(chǎn)生[M+Na]+的離子碎片峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 PⅣ的提取與結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 多糖PⅣ的單糖組成HPLC圖Fig.2 HPLC profile of monosaccharides compositions in polysaccharide PⅣ

從香菇子實(shí)體中提取α-1,3-葡聚糖已有相關(guān)報(bào)道[4]。由于所使用的材料是香菇粗提多糖，而α-1,3-葡聚糖是水不溶性多糖，在粗提過程中有可能造成α-1,3-葡聚糖的丟失，因此有必要對(duì)提取的多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定與驗(yàn)證。PⅣ的單糖組成分析結(jié)果如圖2所示。因?yàn)闊崮z的單糖組成為葡萄糖，本實(shí)驗(yàn)將熱凝膠作為對(duì)照來進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2b所示，通過與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，可以判斷熱凝膠的單糖組成為葡萄糖。PⅣ的單糖組成分析結(jié)果如圖2c所示，PⅣ組分中的單糖組成主要為葡萄糖，也含有少量的木糖與甘露糖。該分析結(jié)果與Zhang Pingyi等[4]的結(jié)果相一致，木糖與甘露糖應(yīng)該是少量來自于LFⅣ的組分。單糖組成分析表明：PⅣ的單糖組成主要為葡萄糖。

圖3 多糖PⅣ的紅外光譜Fig.3 Infrared spectrum of PⅣ

由圖3可知，在2 931 cm－1和1 362 cm－1處有兩組吸收峰，該吸收峰分別代表了糖類化合物C—H伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，而在3 420 cm－1處吸收峰則代表了糖類化合物O—H伸縮振動(dòng)[17]，為多糖特征吸收峰[18]。950～1 250 cm－1范圍內(nèi)有強(qiáng)吸收峰，表示其為呋喃單體。無810 cm－1和875 cm－1處吸收峰則表示不含甘露糖[18]。847 cm－1為α-D-Glc呋喃構(gòu)型的特征吸收峰[17]，在890 cm－1處有吸收峰則表示分子中有β-D-Glc的C—H差相異構(gòu)吸收峰，在圖3中只觀察到844 cm－1處有吸收峰，而890 cm－1處沒有觀察到吸收峰，表明PⅣ不含β-D-Glc單元，PⅣ的葡萄糖單元均為α-D-Glc呋喃構(gòu)型。在822 cm－1處有吸收峰表示該多糖為α-（1→3）-鍵型[19]。有研究表明926、844、822 cm－1為α-（1→3）-D-葡聚糖的特征吸收峰[12]，本實(shí)驗(yàn)可明顯地在929、844、821 cm－1處觀察到吸收峰，說明PⅣ為α-（1→3）-D-葡聚糖。

為進(jìn)一步確定PⅣ的鍵型，對(duì)PⅣ進(jìn)行了1H-NMR分析。H1化學(xué)位移在4.4～4.9范圍之內(nèi)為β-型，而在4.9～5.9范圍之內(nèi)為a-型[20]。PⅣ的1H-NMR分析圖譜如圖4a所示，PⅣ的H1化學(xué)位移為5.11，在5.0～5.5之間，該結(jié)果進(jìn)一步表明多糖PⅣ為α-型多糖。在13C-NMR譜圖中，異頭碳信號(hào)在90～110范圍之內(nèi)，非異頭碳信號(hào)在60～85范圍之內(nèi)。通過α鍵型連接的多糖其異頭碳（C1）信號(hào)在97～101左右，通過β鍵型連接的多糖其異頭碳（C1）信號(hào)在103～105左右[21]。PⅣ的13C-NMR分析圖譜如圖4b所示，從圖中可以看出C1的化學(xué)位移為101.61，這進(jìn)一步表明PⅣ為α-型多糖。83.3是葡萄糖單元通過α-（1→3）連接的C-3化學(xué)位移信號(hào)[22]，在圖4b中可以觀察到83.92的化學(xué)位移信號(hào)，這表明PⅣ多糖中含有α-（1→3）-D-葡聚糖。

圖4 PⅣ的1H-NMR（a）和13C-NMR（b）圖譜Fig.4 1H-NMR (a) and1133C-NMR (b) of PⅣ

2.2 α-1,3-葡聚糖水解混合物的分離與寡糖結(jié)構(gòu)質(zhì)譜表征

α-1,3-葡聚寡糖混合物的分離選用Bio-Gel P4凝膠柱來進(jìn)行。但是在進(jìn)行分離前需要對(duì)水解混合物進(jìn)行脫鹽，在用G10脫鹽過程中，由于葡萄糖極容易與鹽混合為一個(gè)峰，從而造成多糖水解產(chǎn)物脫鹽后的Bio-Gel P4圖譜中1糖峰位置的缺失，因此需要確定葡萄糖經(jīng)Bio-Gel P4柱的出峰時(shí)間，此外也要評(píng)估Bio-Gel P4柱的分離效果。Dextran是α-1,6-葡聚糖，Dextran的水解產(chǎn)物是包含了從1糖到不同聚合度寡塘的混合物。因此首先用Dextran水解產(chǎn)物對(duì)Bio-Gel P4柱效進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)確定葡萄糖單糖的出峰時(shí)間，分離效果圖如圖5a所示，1糖到10糖所在的出峰位置與出峰時(shí)間并且各個(gè)峰形相對(duì)獨(dú)立，這表明Bio-Gel P4柱對(duì)Dextran水解產(chǎn)物具有較好的分離效果。

α-1,3-葡聚糖水解混合物的Bio-Gel P4凝膠色譜分離譜圖如圖5b所示。最后一個(gè)峰的位置與圖5a中的1糖相對(duì)應(yīng)，這表明最后一個(gè)峰所含主要組分為葡萄糖。在多糖寡聚化時(shí)，除用酶解外，用硫酸和鹽酸對(duì)多糖進(jìn)行寡聚化也是主流的寡聚化方法，用硫酸寡聚化的條件下，一般通過形成硫酸鋇來除去硫酸根離子，由于硫酸鋇會(huì)對(duì)多糖和寡糖產(chǎn)生吸附，提高了產(chǎn)品的成本；鹽酸作為水解酸時(shí)，酸解結(jié)束后需要通過G10柱等進(jìn)行脫鹽，增加了工序與成本。但是使用三氟乙酸酸解結(jié)束后，只需要用氮?dú)獯蹈杉纯?，大大降低了成本與損耗。鑒于結(jié)構(gòu)為線性α-1,6-葡聚糖的Dextran水解產(chǎn)物，其經(jīng)過Bio-Gel P4柱分離后依次出現(xiàn)α-1,6-2糖、α-1,6-3糖等不同聚合度的寡糖，因此根據(jù)分離譜圖上峰形良好的組分依據(jù)峰形進(jìn)行收集，每個(gè)獨(dú)立峰形歸為一個(gè)組分，依次命名為F2～F10，對(duì)于剩余不能根據(jù)峰形確定的組分則是在對(duì)每一樣品收集管進(jìn)行MALDI-MS分析后根據(jù)分析的結(jié)果將聚合度分布相同的收集管進(jìn)行合并得到F11～F13。

圖5 多糖水解產(chǎn)物的Bio-Gel P4柱分離圖譜Fig.5 Separation profile of gluco-oligosaccharides from hydrolysates

12 個(gè)寡糖片段（F2～F13）的純度分析初步用HPTLC來進(jìn)行，結(jié)果如圖6所示，每個(gè)寡糖片段主要成分含量占很大比重。為了對(duì)所收集的每個(gè)片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，本實(shí)驗(yàn)采用MALDI-MS來進(jìn)行：由于PⅣ為線性α-1,3-葡聚寡糖，因此，只要知道獲得寡糖的聚合度，就可以得到寡糖的結(jié)構(gòu)。不同寡糖組分的MALDI-MS結(jié)果如表1所示，在每個(gè)寡糖組分中，其所含主要寡糖的聚合度與預(yù)期大小完全一致。此外，結(jié)果同時(shí)表明在10 mmol/L TFA中，100 ℃處理2 h為較好的α-1,3-葡聚糖水解條件。

圖6 12個(gè)寡糖片段的HPTLC分析Fig.6 HPTLC profile of oligosaccharides F2 through F13

表1 Bio-Gel P4柱分離獲得寡糖組分的MALDI-MS和ESI-MSTable1 MALDI-MS and ESI-MS analysis of oligosaccharides present in Bio-Gel P4 fraction

3 結(jié) 論

基于IR圖譜和1H-NMR對(duì)分離獲得的PⅣ組分進(jìn)行分析，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的α-1,3-葡聚糖數(shù)據(jù)，將PⅣ鑒定為線性α-1,3-葡聚糖。在10 mmol/L TFA中，100 ℃處理2 h為較好的α-1,3-葡聚糖水解條件。然后通過色譜分離與MALDI-MS或ESI-MS分析成功獲得了聚合度從2到13的系列線性α-1,3-葡聚寡糖。系列線性α-1,3-葡聚寡糖的成功獲得為進(jìn)一步基于糖芯片技術(shù)獲得與α-1,3-葡聚寡糖具有特異作用關(guān)系的功能蛋白奠定寡糖基礎(chǔ)。

目前在對(duì)寡糖進(jìn)行分離時(shí)，利用常規(guī)的凝膠色譜只能實(shí)現(xiàn)低聚糖的有效分離（聚合度＜7）。對(duì)聚合度相對(duì)較大的寡糖，雖然可以采用高效液相色譜（配RI檢測器）進(jìn)行分析，但是分離的靈敏度相對(duì)較低，并且不能使用梯度洗脫法來進(jìn)行更為有效的分離。為解決梯度洗脫問題，科研工作者建立了柱前衍生，柱后脫衍生的方法：通過將寡糖衍生化獲得熒光基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)在紫外檢測器檢測情況下的有效分析，但隨之而來的問題是分離獲得的寡糖如何高效除去衍生化熒光基團(tuán)問題。在今后工作中，如何獲得有效的柱前衍生和柱后脫衍生方法是亟待解決的問題。

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Structural Identification of α-1,3-Glucan Refined from Mushroom, and Preparation and Characterization of Its Oligomerization Products

ZHANG Hong-tao1, FAN Zun-xiao1, ZHU Li2, ZHAO Xiao-liang3, ZHAN Xiao-bei1,*
(1. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Jiangsu Rayguang Biotech Co. Ltd., Wuxi 214000, China; 3. Key Laboratory of Marine Drugs, Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Purpose: To refine α-1,3-glucan and acquire a series of α-1,3-gluco-oligosaccharides. Methods: Crude polysaccharides from Lentinula edodes fruit bodies was extracted sequentially with 0.9% NaCl, water, and 5% NaOH/0.05% NaBH4, and then fractional preciptitation was conducted by adjustment of the pH to neutrality with 1 mol/L acetic acid . Five fractions were acquired as LFⅠ, LFⅡ, LFⅣ, PⅢ and PⅣ. The structural identification of PⅣ was carried out using HPLC, IR and NMR methods, and then PⅣ was hydrolyzed with 10 mmol/L TFA and separated with FPLC using Bio-Gel P4 column for obtaining a series of oligosaccharides. Each fraction of PⅣ was characterized by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Results: PⅣ was a linear α-1,3-glucan, and 12 kinds of α-1,3-gluco-oligosaccharides were acquired. Conclusion: A library of α-1,3-gluco-oligosaccharides had been established.

α-1,3-glucan; structural identification; nuclear magnetic resonance (NMR); α-1,3-gluco-oligosaccharide; matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS)

O629.1

A

1002-6630（2014）23-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201423001

2014-08-13

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201384）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（3117164）；國家博士后特別資助項(xiàng)目（2014T70472）；國家博士后基金項(xiàng)目（2012M20996）；江蘇博士后基金和江蘇省資助博士后基金項(xiàng)目（1301011B）；國家留學(xué)基金委國家建設(shè)高水平大學(xué)公派研究生項(xiàng)目（2008679005）；111引智計(jì)劃項(xiàng)目（111-2-06）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP1007）

張洪濤（1979—），男，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ芄烟堑暮Y選與生物合成。E-mail：htzhang@jiangnan.edu.cn

*通信作者：詹曉北（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楦唣ざ劝l(fā)酵技術(shù)、微生物多糖生物合成、功能性寡糖制備、生物反應(yīng)器和傳統(tǒng)發(fā)酵食品。E-mail：xbzhan@yahoo.com