秦 雯，梁瑜禎，夏 寧

流行病學(xué)研究顯示，成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)占所有糖尿病患者的2%～12%[1]。國(guó)外2型糖尿病(T2DM)患者中LADA的發(fā)生率為2.8%～10.0%[2-3]；國(guó)內(nèi)臨床調(diào)查顯示LADA約占T2DM患者的7%[4-5]。由于LADA常被誤診為T2DM，不利于盡早進(jìn)行有針對(duì)性的治療，所以對(duì)LADA的早期鑒別和診斷具有重要臨床意義。目前LADA的早期診斷需要對(duì)種類繁多的自身抗體一一進(jìn)行篩查，較為繁瑣，臨床開展不便，因此探尋一種更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法以早期診斷LADA是本研究的切入點(diǎn)。

諸多研究發(fā)現(xiàn)糖蛋白磷脂酶D(GPLD1)參與主要組織相容性復(fù)合體通路。主要組織相容性復(fù)合體是存在于大部分脊椎動(dòng)物基因組中的一個(gè)基因家族，主要組織相容性復(fù)合體通路與代謝和免疫兩大生物過程密切相關(guān)[6]。最近一項(xiàng)以阿爾及利亞人為背景的研究更是詳細(xì)闡述了主要組織相容性復(fù)合體通路與1型糖尿病(T1DM)和LADA的密切聯(lián)系，從側(cè)面印證了GPLD1可能對(duì)T1DM和LADA產(chǎn)生影響[7]。因此，本研究通過觀察早期LADA患者血漿GPLD1水平的變化，分析其與LADA的相關(guān)性及潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例入選與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床明確診斷為糖尿病，且采血前均未使用口服降糖藥或胰島素治療。糖尿病診斷符合2003年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前關(guān)于LADA 的診斷尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究基于以下幾項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)診斷LADA[8-9]：(1)成年起??；(2)診斷糖尿病后至少半年內(nèi)不需要行胰島素治療；(3)胰島自身抗體陽性〔其中谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)的特異度、敏感度相對(duì)較高，也是最持久的抗體，是目前診斷LADA最常用的篩查指標(biāo)[10]〕。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)線粒體基因突變的糖尿病患者；(2)青少年起病的成人型糖尿病患者；(3)其他原因所致的糖尿病和妊娠期糖尿病患者；(4)其他自身免疫疾病患者。

1.2 臨床資料 選取2011年8—12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院來診的符合研究條件的門診患者(LADA組、T1DM組、T2DM組)及健康志愿者(NC組)，均在研究開始前簽署受試者書面知情同意書。其中LADA組58例，年齡(37.2±5.1)歲；T1DM組52例，年齡(12.2±3.8)歲；T2DM組65例，年齡(38.2±4.7)歲；NC組83例，年齡(36.8±4.7)歲。

1.3 方法

1.3.1 血液標(biāo)本的采集 4組受試者均在清晨空腹及早餐后2 h采靜脈血，其中空腹血分為2份，1份分離血漿后于-80 ℃冰箱保存用于GPLD1的檢測(cè)，另1份送本院檢驗(yàn)科用于空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、空腹C肽(FCP)的測(cè)定；餐后2 h血樣用于餐后2 h血糖(2 hPG)、餐后2 h C肽(2 hCP)的測(cè)定。

1.3.2 觀察指標(biāo)的檢測(cè) FPG、2 hPG采用葡萄糖氧化酶法；HbA1c采用高效液相法；FCP、2 hCP采用化學(xué)發(fā)光法；GADA和GPLD1采用ELISA法。以上指標(biāo)除GADA和GPLD1分別采用北京北方生物技術(shù)研究所和武漢優(yōu)爾生公司的試劑盒自行測(cè)試外，其余均由本院檢驗(yàn)科測(cè)試。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較 LADA組和T1DM組的年齡間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LADA組、T1DM組及T2DM組的性別構(gòu)成和病程間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LADA組和其他3組的HbA1c、2 hPG、FCP、2 hCP間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LADA組與T1DM組、NC組FPG間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。因T2DM組和NC組GADA均為陰性，未行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2 血漿GPLD1水平比較 LADA組與T1DM組血漿GPLD1水平間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LADA組血漿GPLD1水平高于T2DM組和NC組(P<0.05，見表2)。

表2 4組受試者血漿GPLD1水平比較

注：GPLD1=糖蛋白磷脂酶D；與LADA組比較，*P<0.05

2.3 相關(guān)性分析及多因素線性回歸分析 Spearman相關(guān)分析顯示，血漿GPLD1水平與HbA1c、FPG、2 hPG呈線性正相關(guān)(P<0.05)，與FCP呈線性負(fù)相關(guān)(P<0.05，見表3)。以血漿GPLD1水平為因變量，以年齡、病程、HbA1c、FPG、2 hPG、FCP、2 hCP為自變量行多因素線性回歸分析顯示，僅FCP進(jìn)入回歸方程(P<0.05，見表4)。

表4 LADA患者GPLD1影響因素的多因素線性回歸分析

Table4 Multiple linear regression analysis on influencing factors for GPLD1 in patients with LADA

回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤t值P值95%CI年齡0054064105550582(-0931， 1642)病程-01903068-18470071(-11830， 0494)HbA1c00811398902430809(-24692， 31505)FPG0081536402940770(-9196， 12352)2hPG-02656015-09560344(-17829， 6334)FCP-083268249-35430001(-378899，-104735)2hCP-004914318-04600648(-35339， 22179)

2.4 血漿GPLD1水平早期診斷LADA的ROC曲線 以GADA陽性作為L(zhǎng)ADA的參考標(biāo)準(zhǔn)，繪制ROC曲線(見圖1)，計(jì)算AUC及95%CI。GPLD1早期診斷LADA的AUC為0.623〔95%CI(0.525,0.721)〕,最佳臨界值為170.53 μg/ml，敏感度和特異度分別為76%和48%。

3 討論

作為一種自身免疫性疾病，目前LADA的診斷主要依靠自身抗體的篩查。但自身抗體在LADA中的滴度通常較低易導(dǎo)致漏診，故本研究旨在尋找可用于LADA早期診斷的臨床指標(biāo)。

GPLD1是一種大量存在于哺乳動(dòng)物血漿中的酶，其功能尚未完全揭曉。人類GPLD1基因位于6號(hào)染色體，由25個(gè)外顯子構(gòu)成[11]。對(duì)于循環(huán)中GPLD1的來源有2種解釋，有報(bào)道認(rèn)為肝臟是人類循環(huán)血中GPLD1的主要來源，然而也有證據(jù)表明炎性反應(yīng)細(xì)胞和胰腺內(nèi)分泌腺也是GPLD1可能的來源。有研究表明人類血漿GPLD1中的氨基酸序列是與胰腺而不是肝臟cDNA編碼的GPLD1氨基酸序列一致，提示人類循環(huán)血中的GPLD1很可能來自胰島而不是肝臟。更有研究發(fā)現(xiàn)GPLD1與胰島素共存于分泌顆粒中[12]，這就增加了自身免疫性糖尿病條件下GPLD1水平改變的可能性。Deeg等[13]在對(duì)T1DM鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)其GPLD1表達(dá)是上調(diào)的。Flores-Borja等[14]研究表明，鼠模型中GPLD1 mRNA水平的增加與其發(fā)展為胰島素依賴性T1DM是同時(shí)的。總之，諸多研究發(fā)現(xiàn)GPLD1與胰島功能及自身免疫性糖尿病密切相關(guān)。

圖1 GPLD1早期診斷LADA的ROC曲線

組別例數(shù)性別(男/女)年齡(歲)病程(月)HbA1c(%)FPG(mmol/L)2hPG(mmol/L)FCP〔M(P25，P75)，μg/L〕2hCP(μg/L)GADA〔n(%)〕LADA組5832/26372±5148±1182±0892±17158±15071(063，076)12±0358(100)T1DM組5228/24122±38?45±1286±08?100±16?170±19?053(043，065)?10±02?52(100)T2DM組6537/28382±4747±1278±07?90±12138±08?187(165，216)?60±15?0 NC組8348/35368±47-51±04?51±07?61±11?148(125，179)?56±19?0 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值0245▲4134350819416729210807985843204547△262050-P值08890000044300000000000000000000-

注：▲為χ2值，△為Z值；HbA1c=糖化血紅蛋白，F(xiàn)PG=空腹血糖，2 hPG=餐后2 h血糖，F(xiàn)CP=空腹C肽，2 hCP=餐后2 hC肽；GADA=谷氨酸脫羧酶抗體；與LADA組比較，*P<0.05；-表示不存在

表3 LADA患者GPLD1與相關(guān)因素的Spearman相關(guān)分析

LADA是一種自身免疫性糖尿病[15]，本研究發(fā)現(xiàn)GPLD1在LADA組和T1DM組中的表達(dá)均增高，這與之前相關(guān)報(bào)道相吻合[7,13]。本研究相關(guān)性分析顯示，血漿GPLD1水平與FCP呈負(fù)相關(guān)，與FPG、2 hPG、HbA1c呈正相關(guān)。FCP水平下降意味著胰島β細(xì)胞功能的損害及自身分泌胰島素水平的下降，而上述國(guó)外研究表明胰島β細(xì)胞功能的自身免疫性破壞可能與血漿GPLD1水平升高有關(guān)[12,14]。這就意味著GPLD1升高時(shí)胰島β細(xì)胞功能是下降的，使血糖的控制受到影響，導(dǎo)致FPG、2 hPG、HbA1c等反映即時(shí)和近期血糖控制情況的指標(biāo)升高。本研究多因素回歸分析進(jìn)一步證實(shí)了FCP是影響血漿GPLD1水平的主要因素。這與之前國(guó)外研究中對(duì)血漿GPLD1水平與自身免疫性糖尿病關(guān)系的諸多推測(cè)相吻合。

至于GPLD1是如何影響胰島β細(xì)胞功能的，可以從GPLD1本身的功能出發(fā)做一推測(cè)。GPLD1本質(zhì)上是一種水解酶，其主要作用于酯鍵，特別是可以對(duì)磷二脂進(jìn)行水解，具體而言就是從GPI錨的脂質(zhì)部分劈開蛋白質(zhì)，使與GPI錨相連的蛋白質(zhì)脫落下來。目前已有研究表明GPLD1能從多種細(xì)胞中水解和自發(fā)釋放不同的錨蛋白，如：GPLD1斷開GPI-錨蛋白連接，使血清堿性磷酸酶的水平受到影響[16-17]；GPLD1斷開GPI-錨蛋白連接，使得與其相連接的癌胚抗原(CEA)從結(jié)直腸癌細(xì)胞表面釋放[18]；GPLD1斷開GPI-錨蛋白連接后產(chǎn)生肌醇磷酸多糖，后者作為第二信使誘發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，引起細(xì)胞因子、胰島素和其他激素的改變[19]。因此，可以對(duì)GPLD1與LADA的關(guān)系做一大膽推測(cè)：GPLD1作為一種水解酶，能斷開GPI-錨，而GPI-錨所連接的蛋白為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新合成的蛋白，這些蛋白的種類和功能各不相同，可以是酶、淋巴因子、激素，也可以是自身抗體、自身抗原；當(dāng)GPLD1 活性增強(qiáng)時(shí)，其水解酶的作用充分發(fā)揮，將GPI-錨所連接的蛋白斷開，這些不同種類和功能的蛋白隨循環(huán)到達(dá)機(jī)體各處，從而對(duì)機(jī)體的代謝等生理功能造成不同的影響；脫落下來的蛋白若為自身抗原或者自身抗體則會(huì)引起機(jī)體免疫功能的紊亂，從而引發(fā)自身免疫性疾病，例如造成胰島β細(xì)胞功能的自身免疫性破壞從而導(dǎo)致LADA。如果這一推測(cè)成立，那么GPLD1在血漿中的水平變化可以看做是LADA等自身免疫性疾病發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，對(duì)疾病的早期預(yù)測(cè)將有重要意義。

本研究還繪制了ROC曲線，分析血漿GPLD1水平對(duì)LADA的早期診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPLD1早期診斷LADA的AUC為0.623。依據(jù)0.5<曲線下面積≤0.7表示診斷價(jià)值一般[20]，故GPLD1尚不能作為診斷LADA的獨(dú)立指標(biāo)。但GPLD1是一種簡(jiǎn)單、可快速檢測(cè)的指標(biāo)，能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)那些有潛在LADA風(fēng)險(xiǎn)的患者給予高度關(guān)注。

總之，LADA患者血漿GPLD1水平是相對(duì)升高的，并且GPLD1在發(fā)病機(jī)制上與LADA關(guān)系密切。同時(shí)血漿GPLD1易于快速檢測(cè)，費(fèi)用不高，可為進(jìn)一步臨床研究奠定基礎(chǔ)；在繼續(xù)增加研究樣本量和臨床實(shí)踐研究的基礎(chǔ)上，血漿GPLD1有望成為早期診斷LADA的一個(gè)十分實(shí)用的指標(biāo)。此外，進(jìn)一步深入探討GPLD1在LADA發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，可能為L(zhǎng)ADA的治療提供新的突破點(diǎn)。

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