張俊霞，徐金升，靳晶晶，白亞玲，張勝雷，崔立文，張慧然

心血管疾病是終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)患者的首位死亡原因，研究顯示血管鈣化尤其中膜鈣化是ESRD患者心血管疾病的重要病因[1]。因此，深入了解血管鈣化，對(duì)降低ESRD患者心血管疾病發(fā)病率，提高其生存率有重要意義。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，血管鈣化是一個(gè)以血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化為特征的細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程。有前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ESRD患者血清可使大鼠VSMCs 核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)表達(dá)升高，Ⅰ型膠原分泌增加[2]，提示ESRD患者血清可刺激VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化進(jìn)而導(dǎo)致鈣化。但ESRD患者體內(nèi)血管鈣化的發(fā)生機(jī)制和確切病因尚不清楚。因橈動(dòng)脈屬于中動(dòng)脈，對(duì)其鈣化特點(diǎn)和機(jī)制的研究可在一定程度上反映ESRD患者心、腦等中動(dòng)脈的情況，為此本研究測(cè)定了ESRD患者橈動(dòng)脈中膜鈣化及Cbfα1和Ⅰ型膠原的表達(dá)情況，旨在探討橈動(dòng)脈中膜鈣化與Cbfα1和Ⅰ型膠原的關(guān)系，為尋求新的早期防治血管鈣化的靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2009年5月—2012年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科住院初次行前臂動(dòng)-靜脈內(nèi)瘺成形術(shù)的ESRD患者62例，其中男38例，女24例；年齡18～81歲，平均(51.6±14.9)歲；原發(fā)?。郝阅I小球腎炎15例,糖尿病腎病10例,高血壓腎病7例,IgA腎病6例，多囊腎3例,梗阻性腎病2例,多發(fā)性骨髓瘤1例，馬兜鈴酸腎病1例，其他17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲者；(2)確診為慢性腎衰竭(尿毒癥期)，符合我國(guó)及美國(guó)腎臟基金會(huì)(K-DOQI)對(duì)慢性腎臟病分期為ESRD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]者；(3)尚未開始腎臟替代治療或腎臟替代治療<2周者；(4)意識(shí)清楚，自愿參與本研究，并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前已經(jīng)存在嚴(yán)重肝臟疾病、惡性腫瘤、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)或減退癥以及近期存在急性炎癥疾病者；(2)已參與其他臨床試驗(yàn)者。以上均經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)論證。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患者行前臂動(dòng)-靜脈內(nèi)瘺成形術(shù)時(shí)留取修剪的橈動(dòng)脈管壁，避免損傷內(nèi)膜和管壁,10%中性甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋。

1.2.2 臨床指標(biāo)檢測(cè) 患者初次行前臂動(dòng)-靜脈內(nèi)瘺成形術(shù)之前(尚未行血液透析時(shí))均測(cè)定空腹血清鈣(Ca)、血清磷(P)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血紅蛋白(Hb)、堿性磷酸酶(ALP)、鐵蛋白、甲狀旁腺素(iPTH)和C反應(yīng)蛋白(CRP)；測(cè)量血壓；計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。

1.2.3 橈動(dòng)脈組織學(xué)分析

1.2.3.1 鈣鹽沉積染色 采用Von Kossa染色法將留取的橈動(dòng)脈組織進(jìn)行鈣鹽沉積染色。方法：5%硝酸銀溶液避光浸染30 min，再經(jīng)紫外線照射30 min,伊紅復(fù)染后脫水、封片。鏡下黑色為陽(yáng)性染色。

1.2.3.2 Cbfα1及Ⅰ型膠原表達(dá)的測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定橈動(dòng)脈管壁Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達(dá)。方法：切片常規(guī)脫蠟，逐級(jí)乙醇溶液水化，3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗山羊抗人I型膠原(1∶200)、山羊抗人Cbfα1(1∶100)(武漢博士德生物工程有限公司)，均置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育 30 min ；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后脫水、透明、封片。鏡下棕黃色為陽(yáng)性染色。

1.2.4 染色結(jié)果判定

1.2.4.1 鈣鹽沉積染色 鈣鹽沉積分為0～4級(jí)。0級(jí):無(wú)鈣鹽沉積；1級(jí):點(diǎn)狀沉積；2級(jí):單個(gè)片狀沉積；3級(jí):多個(gè)片狀沉積；4級(jí):彌漫性圍繞管腔沉積。用von Kossa染片每個(gè)標(biāo)本8張,組織鈣化積分取其平均值,并根據(jù)組織鈣化積分將患者分為無(wú)鈣化組和鈣化組，積分<1.0分納入無(wú)鈣化組；1.0～4.0分納入鈣化組，其中1.0～2.5分為輕中度鈣化，>2.5～4.0分為重度鈣化。

1.2.4.2 免疫組織化學(xué)染色 采用半定量法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例分為4級(jí)：≤24%，0分；25%～50%，1分；51%～74%，2分；≥75%，3分。根據(jù)染色強(qiáng)度分為4級(jí)：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。陽(yáng)性表達(dá)積分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分之和，為0～6分。

2 結(jié)果

2.1 ESRD患者橈動(dòng)脈血管鈣化情況 鈣鹽沉積染色顯示，62例ESRD患者橈動(dòng)脈標(biāo)本中25例發(fā)生血管鈣化，發(fā)生率為40.3%，其中輕中度鈣化22例(35.5%)，重度鈣化3例(4.8%)，均發(fā)生在血管中膜(見圖1)。

注：圖A無(wú)鈣化；圖B輕中度鈣化；圖C重度鈣化；箭頭所指為鈣化

圖1 ESRD患者橈動(dòng)脈血管鈣化情況(Von Kossa染色，×100)

Figure1 Radial artery calcification in ESRD patients

2.2 ESRD患者橈動(dòng)脈Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達(dá)情況 根據(jù)組織鈣化積分，無(wú)鈣化組37例，鈣化組25例。鈣化組橈動(dòng)脈中膜均有Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)；無(wú)鈣化組橈動(dòng)脈中膜31例(83.8%)Cbfα1陽(yáng)性表達(dá)，19例(51.4%)Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)(見圖2)。鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)積分均高于無(wú)鈣化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 兩組ESRD患者臨床指標(biāo)的比較 鈣化組與無(wú)鈣化組的年齡、BMI、血壓、Ca、iPTH、TG、TC、LDL、HDL、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鈣化組血清P水平高于無(wú)鈣化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

注：A圖 Cbfα1陽(yáng)性表達(dá)；B圖 Cbfα1陰性表達(dá)；C圖 Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)；D圖 Ⅰ型膠原陰性表達(dá)

圖2 ESRD患者橈動(dòng)脈Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)

Figure2 The expression of Cbfα1and collagen I of radial arteries in patients with ESRD

表1 兩組橈動(dòng)脈Cbfα1及Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)積分的比較〔M(QR)〕

Table1 Comparison of Cbfα1and collagen I expression of integral between the two groups

組別例數(shù)Cbfα1Ⅰ型膠原無(wú)鈣化組3730(60)05(30)鈣化組2545(30)10(20)Z值-2516-3750P值 0012 0000

注：Cbfα1=核心結(jié)合因子α1

2.4 鈣化組 Cbfα1及Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)積分與臨床指標(biāo)的關(guān)系 Cbfα1陽(yáng)性表達(dá)積分與血清P呈正相關(guān)(P<0.05)，與年齡、BMI、血壓、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)積分與血清P呈正相關(guān)(P<0.05)，與年齡、BMI、血壓、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP無(wú)相關(guān)性(P>0.05，見表3)。Cbfα1陽(yáng)性表達(dá)積分與Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)積分呈正相關(guān)(r=0.307,P<0.05)。

3 討論

流行病學(xué)研究表明，ESRD人群心血管疾病病死率至少是普通人群的10倍[5]，而血管鈣化是ESRD患者常見并發(fā)癥，其作為ESRD患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6-7]，已經(jīng)受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，ESRD患者血管鈣化常見于血管中膜平滑肌層[8]。與血管內(nèi)膜鈣化不同，血管中膜鈣化主要增加血管僵硬度、降低血管順應(yīng)性，損害血管舒張功能，從而導(dǎo)致心律失常和猝死。橈動(dòng)脈與心、腦血管同屬中等肌性動(dòng)脈，對(duì)其進(jìn)行研究有助于早期防治心、腦等中動(dòng)脈血管鈣化，降低ESRD患者心血管疾病病死率。本研究發(fā)現(xiàn)，ESRD患者不同程度的橈動(dòng)脈鈣化發(fā)生率為40.3%，與近期Freercks等[9]報(bào)道相近；且主要發(fā)生在血管中膜，提示ESRD患者血管中膜鈣化發(fā)生率較高，危害性較大。

表2 兩組ESRD患者臨床指標(biāo)的比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，Ca=鈣，P=磷，iPTH=甲狀旁腺素，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白，Hb=血紅蛋白，CRP=C反應(yīng)蛋白，ALP=堿性磷酸酶；1 mm Hg=0.133 kPa

表3 鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原陽(yáng)性表達(dá)積分與臨床指標(biāo)的關(guān)系

ESRD患者橈動(dòng)脈中膜鈣化的機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為血管鈣化的主要機(jī)制之一是VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[10]。而VSMCs表型轉(zhuǎn)化是細(xì)胞嚴(yán)密調(diào)節(jié)下的轉(zhuǎn)化過(guò)程，其中骨源性轉(zhuǎn)錄因子Cbfα1是該過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子。Cbfα1是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員之一，是成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞成熟的必需因子[11-12]。在動(dòng)物體內(nèi)研究中，以特異性敲除血管平滑肌細(xì)胞Cbfα1基因的小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)其可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管鈣化過(guò)程[13]。本研究結(jié)果顯示，橈動(dòng)脈中膜鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)積分均高于無(wú)鈣化組。 I型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，約占血管壁膠原成分的60%，屬于“間隙膠原”，在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，與之前細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[2]相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，橈動(dòng)脈血管中膜Cbfα1與Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)積分呈正相關(guān)，這也與目前關(guān)于Cbfα1可以正向調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白基因表達(dá)的研究相一致[14]。以上結(jié)果均提示Cbfα1、Ⅰ型膠原在ESRD患者橈動(dòng)脈中膜鈣化中起著重要作用，Cbfα1可作為治療動(dòng)脈中膜鈣化的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，在37例無(wú)鈣化的血管標(biāo)本中，仍有31例Cbfα1表達(dá)陽(yáng)性及19例I型膠原表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明血管中膜骨特異性蛋白表達(dá)可能是血管鈣化的早期表現(xiàn)，進(jìn)一步提示橈動(dòng)脈中膜鈣化是細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)過(guò)程。

為進(jìn)一步探討誘導(dǎo)血管中膜VSMCs表型轉(zhuǎn)化的因素，本研究分析了兩組患者的臨床指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣化組血清P水平高于非鈣化組；進(jìn)一步相關(guān)分析顯示，血清P水平與Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽(yáng)性表達(dá)積分亦呈明顯正相關(guān)，與Li等[15]的體外實(shí)驗(yàn)相一致。提示在ESRD患者中高磷血癥通過(guò)誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞高表達(dá)Cbfα1，進(jìn)而分泌I型膠原參與鈣化。但高血清P誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，ESRD患者橈動(dòng)脈中膜鈣化的發(fā)生率較高，其可能與高P誘導(dǎo)血管中膜VSMCs表型轉(zhuǎn)化，促使I型膠原表達(dá)增加有密切關(guān)系。Cbfα1作為VSMCs表型轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子有望成為治療ESRD患者血管中膜鈣化的重要靶點(diǎn)。然而，本研究也有一定的局限性，如因橈動(dòng)脈組織標(biāo)本留取較為困難，所以納入研究的樣本量相對(duì)較少。因此今后還需擴(kuò)大樣本量并設(shè)計(jì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討ESRD患者中膜鈣化的機(jī)制。

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