朱虹嫻，胡佳麗，戚正華，馬美蘭，張悅凱

（東陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江東陽 322100）

鐵皮石斛培養(yǎng)基配方篩選

朱虹嫻，胡佳麗，戚正華，馬美蘭，張悅凱

（東陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江東陽 322100）

以鐵皮石斛種子、一年生嫩莖為外植體，通過試驗(yàn)篩選種子培養(yǎng)、原球莖增殖、分化成苗、壯苗生根4個(gè)階段的最佳配方。結(jié)果顯示，鐵皮石斛苗在MS培養(yǎng)基中生長狀況最好；種子培養(yǎng)最佳配方為MS+0.5 mg· L-1NAA+15%土豆；當(dāng)添加NAA的濃度為0.2 mg·L-1，6-BA的濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，鐵皮石斛原球莖的增殖率達(dá)到最高；適合分化的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1NAA；鐵皮石斛壯苗生根的較佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA+8%香蕉。

鐵皮石斛；無菌繁殖；配方篩選

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科石斛屬多年附生草本植物，是名貴中藥楓斗的原材料［1］，有“除脾下氣，補(bǔ)五臟虛勞羸弱，強(qiáng)陰，久服厚腸胃，輕身延年”［2］之功效。近年來，許多學(xué)者對鐵皮石斛的有效成分及作用進(jìn)行了研究，表明其含有多糖、氨基酸及多種元素，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖的作用［3］。隨著藥材市場對石斛的需求量不斷上升，多年的過度開采使得野生資源枯竭，用傳統(tǒng)的無性繁殖方式繁殖石斛，其繁殖系數(shù)過低，大面積栽培種苗數(shù)量無法得到滿足，并且成活率低，產(chǎn)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場的需求［4-5］，本試驗(yàn)旨在通過篩選鐵皮石斛種子培養(yǎng)、原球莖增殖、芽分化及壯苗生根的最適培養(yǎng)基，探索并建立一套適宜鐵皮石斛生長的組培快繁體系，以促進(jìn)東陽鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用浙江農(nóng)林大學(xué)提供的鐵皮石斛成熟種子及金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供的鐵皮石斛莖段。

試驗(yàn)用的試劑有75%酒精，次氯酸鈉，蔗糖，瓊脂，活性炭，芐基腺嘌呤（6-BA），萘乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）；還有土豆（pt）、香蕉（bn）、無菌水。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

鐵皮石斛成熟種子經(jīng)自來水沖洗30 min，用75%的酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗3次后備用。

鐵皮石斛健壯嫩莖用自來水沖洗30 m in，摘去葉片及膜質(zhì)葉鞘，用75%的酒精浸泡30 s，并用5%～10%次氯酸鈉浸泡8～10 min［6］，再用無菌水沖洗4～5次，切成0.5 cm莖段備用。

培養(yǎng)基中添加20 g·L-1蔗糖，6 g·L-1瓊脂，0.5 g·L-1活性炭，調(diào)節(jié)pH值為5.8。

1.2.2 基本培養(yǎng)基篩選

將準(zhǔn)備好的莖段均勻接種在MS，1/2MS，B5，M6等4種培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基配方10瓶，并做好標(biāo)記，每瓶接種10個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)條件為溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，時(shí)間14 h·d-1，環(huán)境濕度60%～80%。30 d為一個(gè)周期，觀察其生長情況。

1.2.3 初代培養(yǎng)基篩選

初代培養(yǎng)基配方4種：MS+0.5 mg·L-1NAA+ 15%pt，MS+0.5 mg·L-1NAA，MS+2.0 mg· L-16-BA，MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA。將準(zhǔn)備好的成熟種子切開均勻撒在添加不同植物激素的4種培養(yǎng)基上，每個(gè)配方10瓶，培養(yǎng)條件為溫度20～25℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，時(shí)間12 h·d-1，環(huán)境濕度60%～80%。培養(yǎng)30 d，觀察萌發(fā)情況。

1.2.4 原球莖增殖培養(yǎng)基篩選

增殖培養(yǎng)基配方為在MS+0.2 mg·L-1NAA的基礎(chǔ)上，分別加0.5，1.0，2.0，3.0 mg·L-16-BA，以不加激素的作對照。種子萌發(fā)后培養(yǎng)的原球莖接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基中，每個(gè)配方重復(fù)10次，每瓶接種10個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)條件為溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，時(shí)間12 h·d-1，環(huán)境濕度60%～80%。培養(yǎng)30 d，觀察增殖情況。

1.2.5 繼代（分化）培養(yǎng)基篩選

設(shè)置在加0.0或0.2 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基上，分別加0.0，0.5，1.0 mg·L-1NAA共6個(gè)配方。將增殖所得的原球莖接種于分化培養(yǎng)基中，每個(gè)配方重復(fù)10次，每瓶接種10個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)條件為溫度25～28℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，時(shí)間12 h·d-1，環(huán)境濕度60%～80%。培養(yǎng)30 d，觀察出苗情況。

1.2.6 壯苗生根培養(yǎng)基篩選

設(shè)置在加0.0或0.5 mg·L-1IBA的MS加香蕉80 g·L-1的培養(yǎng)基上，分別加0.0，0.5，1.0 mg· L-1NAA共6個(gè)配方。將2～3 cm高的小苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基中，每個(gè)配方重復(fù)10次，每瓶接種10個(gè)點(diǎn)，培養(yǎng)條件為溫度25～28℃，光照2 500～3 000 lx，時(shí)間14 h·d-1，環(huán)境濕度60%～80%。培養(yǎng)60 d，觀察苗的長勢及生根狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基

表1表明，MS，1/2MS和B5基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的莖段均有小芽冒出，但是MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的莖段產(chǎn)生大量白色小芽，并且小芽生長速度較其他培養(yǎng)基快，所以MS為最佳基本培養(yǎng)基。

表1 鐵皮石斛莖段在不同基本培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況

2.2 初代培養(yǎng)基

表2表明，在4個(gè)配方的培養(yǎng)基中，添加土豆的配方，種子萌發(fā)得較好，且芽較綠于其他3個(gè)配方；添加6-BA激素的培養(yǎng)基，種子萌發(fā)情況不佳；加入一定濃度的NAA，有利于促進(jìn)種子萌發(fā)，使萌發(fā)時(shí)間、數(shù)量、生長速度均達(dá)到較理想的水平。

表2 鐵皮石斛種子不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況

2.3 原球莖增殖培養(yǎng)基

表3表明，添加6-BA激素配合一定的NAA有利于原球莖的增殖，當(dāng)6-BA 2.0 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1的激素配比時(shí)鐵皮石斛原球莖增殖最佳。

2.4 繼代（分化）培養(yǎng)基

表4表明，原球莖分化隨NAA濃度的增高而呈現(xiàn)分化不整齊的現(xiàn)象，添加6-BA激素的培養(yǎng)基分化不理想。6個(gè)配方以MS+0.5 mg·L-1NAA的較佳。

表3 鐵皮石斛原球莖在不同培養(yǎng)基上的增殖情況

2.5 壯苗生根培養(yǎng)基

表5表明，培養(yǎng)基添加香蕉后，鐵皮石斛壯苗長根速度較快，添加0.5 mg·L-1NAA和0.5 mg· L-1IBA后，苗長勢粗壯，莖段分明，葉片飽滿，而無添加植物生長調(diào)節(jié)劑的則表現(xiàn)葉發(fā)黃、莖不正常、根少。表明MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+香蕉80 g·L-1培養(yǎng)基較利于鐵皮石斛壯苗生根。

表4 鐵皮石斛小苗在不同培養(yǎng)基上的分化情況

表5 鐵皮石斛壯苗在不同培養(yǎng)基上生根的情況

3 小結(jié)與討論

經(jīng)鐵皮石斛從種子萌發(fā)到壯苗生根的培養(yǎng)試驗(yàn)，得出相應(yīng)的最佳培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基以MS為宜；種子培養(yǎng)以MS+0.5 mg·L-1NAA+15%pt為最佳，有利于種子轉(zhuǎn)綠及膨大；對于原球莖誘導(dǎo)和增殖，培養(yǎng)基中的激素種類和濃度，以同時(shí)添加較高濃度的6-BA（2.0 mg·L-1）和低濃度NAA（0.2 mg·L-1）最好；適合分化的培養(yǎng)基為MS+ 0.5 mg·L-1NAA；壯苗生根以MS+0.5 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基為最佳，莖粗苗高葉長根多，效果最好。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，鐵皮石斛幼苗生根率為100%，且長勢良好、生長健壯。李小軍等［7］認(rèn)為添加香蕉泥對石斛試管苗的生根有利，可以促使幼苗生根時(shí)間提前，本試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。

［1］ 楊一令，來平凡，蔣士鵬.鐵皮石斛研究進(jìn)展［J］.山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（1）：82-85.

［2］ 魏·吳普等述，清·孫星衍等輯.神農(nóng)本草經(jīng)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：21.

［3］ 劉燦蘭，尚子義，曲衛(wèi)玲.鐵皮石斛保健產(chǎn)品的研究開發(fā)價(jià)值［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2010：29.

［4］ 包雪聲，順慶生，陳立鉆.中國藥用石斛［M］.上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，復(fù)旦大學(xué)出版社，2001.

［5］ 瑞南.珍稀瀕危植物石斛［J］.中國林業(yè)，2005：15.

［6］ 李桂鋒，鐵皮石斛組培快繁工藝及規(guī)范化生產(chǎn)體系研究［D］.廣州中醫(yī)藥，2008：14

［7］ 李小軍，石泉，維陵，等.香蕉提取物對霍山石斛試管苗壯苗的影響［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，25（6）：469-472.

（責(zé)任編輯：張才德）

S 567

A

0528-9017（2014）11-1699-03

文獻(xiàn)著錄格式：朱虹嫻，胡佳麗，戚正華，等.鐵皮石斛培養(yǎng)基配方篩選［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（11）：1699-1671.

2014-08-12

鐵皮石斛組培育苗培養(yǎng)基的篩選項(xiàng)目

朱虹嫻（1990-），女，浙江義烏人，本科，主要從事植物組培技術(shù)研究工作。E-mail：739540610@qq.com。