張?zhí)煊?張金超 劉 妙 吳若菡 張淑靜 高譽(yù)珊 鄭豐杰 許 紅 李宇航

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029；北京中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)方現(xiàn)代應(yīng)用關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究創(chuàng)新團(tuán)隊，北京，100029）

“通利大腸”對COPD模型大鼠肺組織SP、VIP含量的影響

張?zhí)煊?張金超 劉 妙 吳若菡 張淑靜 高譽(yù)珊 鄭豐杰 許 紅 李宇航

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029；北京中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)方現(xiàn)代應(yīng)用關(guān)鍵科學(xué)問題的基礎(chǔ)研究創(chuàng)新團(tuán)隊，北京，100029）

目的：觀察“通利大腸”對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型大鼠肺組織P物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）含量的影響，從神經(jīng)肽角度探討COPD“從腸論治”的效應(yīng)機(jī)制。方法：采用熏煙聯(lián)合氣管注射脂多糖復(fù)制COPD大鼠模型。50只雄性大Wistar鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、治腸組、治肺組、肺腸同治組。正常組和模型組均灌胃給予生理鹽水，治腸組、治肺組、肺腸同治組分別用治腸藥（生大黃）、治肺藥（生石膏、苦杏仁、瓜蔞皮）、肺腸同治藥（生大黃、生石膏、苦杏仁、瓜蔞皮）灌胃，連續(xù)7 d。用免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測肺組織中SP、VIP含量。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織SP表達(dá)較強(qiáng)，而治腸組、治肺組、肺腸同治組表達(dá)較弱；VIP在正常大鼠支氣管上皮表達(dá)較強(qiáng)，模型組表達(dá)明顯減弱，各治療組VIP表達(dá)明顯增強(qiáng)。酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果顯示，與正常組相比，SP在模型組肺組織中含量明顯升高，VIP含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，治腸組、治肺組、肺腸同治組肺組織SP含量均明顯降低，VIP含量明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；與治肺組相比，肺腸同治組肺組織SP含量明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：通利大腸或治肺基礎(chǔ)上增加通利大腸，可調(diào)節(jié)COPD模型大鼠肺組織神經(jīng)肽SP、VIP的含量，這可能是COPD“從腸論治”的效應(yīng)機(jī)制之一。

慢性阻塞性肺疾?。簧窠?jīng)肽；從腸論治

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。臨床和實驗研究均發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病和哮喘急性發(fā)作時患者血液、誘導(dǎo)痰中P物質(zhì)、血管活性腸肽等神經(jīng)肽的含量、肺組織中其免疫陽性纖維的表達(dá)均存在明顯異常[2-3]，應(yīng)用神經(jīng)肽受體拮抗劑可有效降低氣道反應(yīng)，提高肺功能，改善肺通氣功能障礙[4-5]。

通腑瀉下法是“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下“從腸論治”肺病的中醫(yī)臨床常用治療方法之一，不但可以有效改善腸道功能，同時亦可明顯改善呼吸困難和氣體交換功能[6]。本課題組前期研究表明，“通利大腸”或治肺基礎(chǔ)上增加通利大腸，可增加對氣管注射脂多糖加熏煙致COPD模型大鼠肺功能和血氣的改善程度[7]，本研究旨在通過觀察宣白承氣湯拆方對COPD模型大鼠肺組織SP、VIP含量的影響，從神經(jīng)肽分泌角度探討從腸論治COPD的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 采用清·吳鞠通《溫病條辨·卷二》宣白承氣湯（生石膏五錢、生大黃三錢、杏仁粉二錢、瓜蔞皮一錢五分），根據(jù)藥物功效與歸經(jīng)將其拆分為三組，即治肺組（生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蔞皮4.5 g）、治腸組（生大黃9 g）、肺腸同治組（生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蔞皮4.5 g，大黃9 g）。中藥飲片購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定均為正品。依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，并擴(kuò)大10倍。各組藥物分別以蒸餾水煎煮30 min，提取2次，再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。

1.2 動物與分組 清潔級健康Wistar雄性大鼠，50只，體重（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物公司，合格證號SCXK（京）2009-0011。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、治腸組、治肺組和肺腸同治組，每組10只。第22～28 d，各給藥組每天1次灌胃給與相應(yīng)中藥，正常組及模型組給予等量自來水灌胃。各組于末次給藥后，禁食12 h后，處死取材。

1.3 模型制備 參照文獻(xiàn)[8]采用氣管注脂多糖加熏香煙方法復(fù)制COPD大鼠模型，即在第1 d和第14 d，用1%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 m L注射器注入溶于生理鹽水的LPS200μL（1mg/mL），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。第2～28 d（第14 d除外）將大鼠置入60 cm ×50 cm×40 cm熏吸箱內(nèi)，注入大前門牌過濾嘴香煙煙霧，濃度約5%，每天上午、下午各1 h。

1.4 儀器與試劑 動物熏煙箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制。18號靜脈套管針（馬來西亞制造）。脂多糖（LPS，Sigma公司）；大前門牌香煙（上海煙草公司，烤煙型，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg）。TECAN全波長酶標(biāo)儀（Thermo，Multiskan MK3）。

兔抗SP抗體（2853711，博士德）、兔抗VIP抗體（Y-07B11B，博士德）；邁新試劑-即用型免疫組化超敏試劑盒（1208319706，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；4%多聚甲醛溶液、0.1 mol/L磷酸緩沖液、二甲苯、石蠟、無水乙醇、檸檬酸抗原修復(fù)液、DAB、中性樹脂等；大鼠P物質(zhì)ELISA試劑盒（M27039504，Cusabio），血管活性腸肽ELISA試劑盒（M27039505，Cusabio）。

圖1 肺組織SP免疫組化染色×40

圖2 肺組織VIP免疫組化染色×40

1.5 樣品處理及檢測 腹主動脈取血處死，冰上打開胸、腹腔，分離取材肺臟組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，PBS洗5 min×3次，微波抗原修復(fù)10 min，PBS洗5 min×3次，加封閉血清室溫孵育15 min，加一抗（SP抗體、VIP抗體）4℃過夜，PBS洗5 min ×3次，加二抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次，加三抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色劑顯色，沖洗，脫水，中性樹膠封片。

腹主動脈取血處死，冰上打開胸、腹腔，分離取材肺臟組織，液氮速凍，移植-80℃冰箱保存。應(yīng)用Cusabio公司的生產(chǎn)的ELISA試劑盒，檢測肺組織勻漿中SP及VIP含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；兩兩比較方差齊者采用LSD（Least-Significant Difference）檢驗，方差不齊者采用Dunnett'T3檢驗，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織中SP、VIP免疫組化分析 如圖1、圖2所示：SP在正常大鼠肺支氣管上皮、肺間質(zhì)中可見表達(dá)，模型組較正常組表達(dá)增強(qiáng)，與模型組相比，治腸組、肺腸同治組SP表達(dá)減弱。VIP在正常大鼠支氣管上皮表達(dá)較強(qiáng)，模型組表達(dá)明顯減弱，各治療組VIP表達(dá)明顯增強(qiáng)。

2.2 肺組織中SP及VIP含量比較 如表1所示：與正常組相比，模型組肺（1.49±0.37 vs 0.78±0.07）中SP含量明顯升高，模型組肺VIP含量（1.06± 0.30vs0.51±0.20）明顯降低。與模型組相比，治腸組、治肺組、肺腸同治組肺組織SP含量均明顯降低，VIP含量均明顯升高。與治肺組相比，肺腸同治組肺組織SP含量明顯降低。

表1 各組大鼠肺組織勻漿SP、VIP含量分析（mean±SD）

3 討論

在“肺與大腸相表里”理論指導(dǎo)下，借助肺與大腸之間特殊聯(lián)系，中醫(yī)藥采用“肺病治腸法”在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、急性呼吸窘迫綜合證等肺病的防治中常可獲得出人意料的臨床療效[6，9]，其效應(yīng)機(jī)制與黏膜免疫、微生態(tài)、淋巴循環(huán)、內(nèi)分泌等有關(guān)[10-11]。本課題組既往研究也表明“通利大腸”可改善COPD大鼠肺組織的病理形態(tài)和肺功能，增強(qiáng)抑制COPD大鼠氣道黏液高分泌的作用，促進(jìn)SIgA分泌，增強(qiáng)呼吸道和腸道黏膜免疫功能，從而進(jìn)一步改善氣道通氣及肺功能[12-13]。

神經(jīng)肽作為一種內(nèi)源性活性物質(zhì)，既存在于神經(jīng)組織，也在肺、腸等外周組織和器官中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)：P物質(zhì)（SP）既與哮喘、慢性阻塞性肺疾病的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性形成密切有關(guān)[14]，同時也能腸道黏液分泌、刺激腸道運動[15]。VIP在胃腸道中含量最高，通過與受體VPAC1、VPAC2相結(jié)合，參與腸道舒張，液體分泌等作用[16]，同時也在肺內(nèi)廣泛分泌，發(fā)揮支氣管舒張、肥大細(xì)胞組織胺釋放調(diào)節(jié)等作用[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴注脂多糖加熏香煙制備的COPD大鼠模型肺組織中神經(jīng)肽SP、VIP均存在異常分泌，表現(xiàn)為SP含量增加、VIP含量減少，提示神經(jīng)肽SP、VIP的分泌參與了COPD的病理過程。與模型組相比，用生大黃從腸干預(yù)后，對肺組織中SP、VIP的分泌具有顯著調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為SP含量的降低和VIP含量的升高，提示通利大腸有助于調(diào)節(jié)肺神經(jīng)肽分泌，進(jìn)而改善氣道黏液高分泌狀態(tài)和氣道平滑肌收縮引起的管腔狹窄；與治肺組相比，在治肺基礎(chǔ)上增加通利大腸可進(jìn)一步減少SP在肺組織中的表達(dá)，VIP的含量亦有增加趨勢。因此，通利大腸或在治肺基礎(chǔ)上增加通利大腸，均能增強(qiáng)抑制COPD模型大鼠肺組織SP分泌、增加VIP分泌作用，從而進(jìn)一步改善氣道通氣障礙，提示神經(jīng)肽分泌調(diào)節(jié)可能是COPD從腸論治效應(yīng)產(chǎn)生的作用環(huán)節(jié)之一，其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

致謝：感謝北京中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室王謙教授在本文形態(tài)學(xué)方面給予的指導(dǎo)。

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（2014-03-11收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Effect of Relaxing Large Intestine Therapy on Contents of SP and VIP in Lung Tissues of Rat Models with Chronic Obstructive Pulmonary Diseases

Zhang Tianyu，Zhang Jinchao，Liu Miao，Wu Ruohan，Zhang Shujing，Gao Yushan，Zheng Fengjie，Xu Hong，Li Yuhang
（School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To observe the influence of relaxing large intestine therapy on contents of substance P（SP）and vasoactive intestinal peptide（VIP）in ratmodel with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and exp lore the effective mechanism of treating COPD based on relaxing the large intestine from the aspect of neuropeptide.Methods：Ratsmodel of COPD were established through intratracheal injection of LPS combined with cigarette smoking.Fifty Wistar rats were randomly divided in to normal group，model group，intestine group，lung group and lung-intestine group.The normal group and model group were intragastrically given normal saline solution and other groups were treated with corresponding decoction intragastrically for 7 days.The content of SP and VIP were detected by immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Immunohistochemistry results showed that compared with control group，SP in lung tissue of model group was abundantly expressed while in lung group and intestine group and lung-intestine group were weakly expressed.VIP in bronchial epithelium of control group was expressed broadly while model group were lower.After treatment，VIP was increased significantly in trial groups.Enzyme-linked immunosorbent assay showed that compared with control group，SP was increased in lung tissue inmodel group while VIPwere decreased significantly（P＜0.01）.Compared withmodel group，SPwas lower in lung group，intestine group and lung-intestine group.VIPwas increased significantly（P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with lung group，SPwas reduced significantly in lung-intestine group（P＜0.05）.Conclusion：The expression of SP and VIP were regulated by the therapy of relaxing the large intestine or relaxing the large intestine on the base of treating lung disease.Thismay be one of the mechanisms of why treating from intestine is effective on COPD.

Chronic obstructive pulmonary diseases；Neuropeptide；Treatment based on large intestine

R256.1；R332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.003

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（編號：2009CB522704）

張?zhí)煊?，碩士研究生，E-mail：zhangtianyu88016＠126.com

李宇航，北京市北三環(huán)東路11號北京中醫(yī)藥大學(xué)，郵編：100029，電話：（010）64287503，E-mail：liyuhang＠bucm.edu.cn