鄭秀麗 楊 宇 王寶家 唐洪屈 周新穎
(成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院四川,成都,610075)
從潰瘍性結(jié)腸炎大鼠呼吸道與腸道微生態(tài)同步動態(tài)變化探討“肺與大腸相表里”
鄭秀麗 楊 宇 王寶家 唐洪屈 周新穎
(成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院四川,成都,610075)
目的:觀察潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)大鼠在“腸病及肺”過程中呼吸道和腸道微生態(tài)的同步動態(tài)變化情況,探討中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論的微生態(tài)機制。方法:以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇相結(jié)合的方法誘導實驗性大鼠UC模型,分別在造模后第8天、第29天和第50天三個時間點對呼吸道和腸道的需氧菌總數(shù)、厭氧菌總數(shù)、腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌進行同步檢測。結(jié)果:UC大鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),益生菌數(shù)量減少,條件致病菌數(shù)量增多。其呼吸道部分菌群同步出現(xiàn)相關(guān)變化。造模后第8天,需氧菌總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多,厭氧菌總數(shù)和腸桿菌在腸道增多而在呼吸道減少。造模后第29天,需氧菌總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步減少,厭氧菌總數(shù)和腸桿菌在腸道減少而在呼吸道增多;造模后第50天,呼吸道和腸道的需氧菌總數(shù)、厭氧菌總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多。結(jié)論:腸病大鼠可出現(xiàn)呼吸道菌群的改變,在“腸病及肺”病理傳變過程中,腸病大鼠呼吸道和腸道的部分菌群出現(xiàn)同步增多或減少的相關(guān)性變化,提示微生態(tài)菌群的變化可能是“腸病及肺”的機制和表現(xiàn)形式之一。
UC;肺與大腸相表里;腸病及肺;腸道微生態(tài);呼吸道微生態(tài)
“肺與大腸相表里”是頗具中醫(yī)特色的臟腑相關(guān)理論之一。肺與大腸經(jīng)脈絡(luò)屬,生理上相互協(xié)調(diào),病理上相互影響(肺病及腸,腸病及肺),治療上相互為用(肺病治腸、腸病治肺、肺腸同治)。鑒于該理論在生理、病理、臨床治療等方面的重要意義,開展關(guān)于“肺與大腸相表里”這一臟腑相關(guān)理論的應(yīng)用基礎(chǔ)研究十分必要。
有關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)的前期研究發(fā)現(xiàn),該病可以特異性引起肺支氣管病損,肺損傷是該病的腸外表現(xiàn)之一[1-2]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)[3-5],UC模型大鼠可出現(xiàn)肺功能減弱和肺組織形態(tài)改變,如肺和支氣管出現(xiàn)上皮細胞變性、壞死、脫落、管腔內(nèi)炎性滲出等;從三個時間節(jié)點對該模型進行的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),“腸病及肺”是否發(fā)生,主要取決于腸病的病理損傷程度,肺臟的病理損傷程度,與腸病的病變時間成正比。本研究擬從觀察UC大鼠在“腸病及肺”過程中腸道和呼吸道微生態(tài)的同步動態(tài)變化切入,探討中醫(yī)“肺與大腸相表里”理論的微生態(tài)機制。
2.1 實驗材料
2.1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠65只,體重(180±20)g,購自成都達碩生物科技有限公司(動物合格證號:scxk(川)2008-24)。
2.1.2 主要藥物與試劑 TNBS(SIGMA公司,批號:109k5008);腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基均購自北京陸橋生物科技有限公司。
2.2 實驗方法
2.2.1 動物分組 65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,隨機分為空白對照組(30只)和腸病模型組(35只),分別在造模第8天、第29天、第50天隨機抽取模型動物10只處死觀察,構(gòu)成模型1組(腸病第8天組),模型2組(腸病第29天組)和模型3組(腸病第50天組)三組模型??瞻讓φ战M亦分別于上述各相應(yīng)時間點隨機抽取10只處死與模型組進行對比觀察。
2.2.2 造模 以三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇相結(jié)合的方法誘導實驗性大鼠UC模型。大鼠以2.4%水合氯醛0.8~1.0 mL/100 g腹腔注射麻醉后,在石蠟油潤滑下,經(jīng)腸道輕緩插入輸液管至距肛門8 cm處將100 mg/kg TNBS加入等體積50%乙醇,注入大鼠結(jié)腸,然后注入約0.5 m L空氣,將大鼠頭部向下傾斜45度放置1 min,然后保持平躺自然清醒??瞻讓φ战M大鼠按上述方法給予等量生理鹽水灌腸。造模3 d后從模型組隨機抽取2只大鼠,取結(jié)腸組織,做普通光鏡下病理形態(tài)學觀察,確定模型是否復制成功,模型成功標準參照文獻[3]。于首次造模后每7 d按上述方法和劑量對模型組大鼠重復造模,直至實驗結(jié)束??瞻讓φ战M大鼠按上述方法給予等量生理鹽水灌腸。
2.2.3 標本采集與制備 分別在造模第8天、第29天、第50天隨機抽取模型組和同時間點的空白組大鼠各10只進行標本采集。同步收集結(jié)腸內(nèi)容物和支氣管肺泡灌洗液,用于腸道菌群和呼吸道菌群的同步檢測。結(jié)腸內(nèi)容物的收集方法:2.4%水合氯醛1.0~1.2 mL/100 g腹腔注射麻醉,打開腹腔,剖開結(jié)腸,取結(jié)腸內(nèi)容物(糞便)0.1 g,加入稀釋液進行10倍稀釋備用。支氣管肺泡灌洗液的收集方法:暴露氣管和肺,結(jié)扎左肺,將無菌生理鹽水8mL注入右肺,反復沖洗,回抽支氣管肺泡灌洗液4~5 mL,放入無菌離心管備用。
2.2.4 標本培養(yǎng)與檢測方法 實驗標本經(jīng)10倍系列稀釋后,選擇適當稀釋度接種平板,每稀釋度接種2個平行樣,每個樣每樣點種20μL,培養(yǎng)后經(jīng)鑒定和計數(shù)平板上的目標菌落數(shù)N1,計算原始樣品中的菌落數(shù)V。對結(jié)腸內(nèi)容物標本:V(cfu/g糞便)=50N1×稀釋倍數(shù);對支氣管肺泡灌洗液標本:V(cfu/m L灌洗液)=50N1×稀釋倍數(shù)。再將得到的菌落形成單位(CFU)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對數(shù)值(lg),完成統(tǒng)計運算。腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版第148 -153頁調(diào)節(jié)腸道菌群功能檢驗方法;需氧細菌計數(shù)以及厭氧細菌計數(shù)原理參照GB 4789.2食品微生物學檢驗之菌落總數(shù)測定。
2.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量數(shù)據(jù)以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3.1 各組大鼠腸道菌群檢測結(jié)果 見表1。與空白組比較,腸病模型大鼠第8天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著增多(P<0.05或P<0.01),而葡萄球菌顯著減少(P<0.05)。腸病模型大鼠第29天腸道葡萄球菌、腸球菌、乳酸桿菌、厭氧總數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。腸病模型大鼠第50天腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。與腸病模型大鼠第8天比較,腸病模型大鼠第29天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌、厭氧總數(shù)和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01);腸病模型大鼠第50天腸道需氧總數(shù)、腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。與腸病模型大鼠第29天比較,腸病模型大鼠第50天腸道葡萄球菌和腸球菌均顯著增多(P<0.01)。
3.2 各組大鼠呼吸道菌群檢測結(jié)果 見表2。與空白組比較,腸病模型大鼠第8天呼吸道厭氧總數(shù)顯著減少(P<0.01),葡萄球菌顯著增多(P<0.05)。腸病模型大鼠第29天呼吸道菌群無顯著變化(P>0.05)。腸病模型大鼠第50天呼吸道厭氧總數(shù)顯著增多(P<0.05)。與腸病模型大鼠第8天比較,腸病模型大鼠第29天呼吸道需氧總數(shù)和葡萄球菌顯著增多(P<0.01),厭氧總數(shù)顯著減少(P<0.01);腸病模型大鼠第50天呼吸道厭氧總數(shù)顯著增多(P<0.01)。與腸病模型大鼠第29天比較,腸病模型大鼠第50天呼吸道需氧總數(shù)和葡萄球菌顯著增多(P<0.01)。
表1 各組大鼠腸道菌群檢測結(jié)果比較(±s)
表1 各組大鼠腸道菌群檢測結(jié)果比較(±s)
注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型第8天比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型第29天比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。
組別例數(shù)需氧總數(shù) 厭氧總數(shù) 葡萄球菌 產(chǎn)氣莢膜梭菌 腸桿菌 腸球菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌.71±0.57 5.25±0.44 8.69±0.81 9.04±0.74模型第8天10 8.47±0.47*9.45±0.58 3.15±0.37*8.00±0.60**7.67±0.40**5.76±0.56 8.72±0.45 9.19±0.29模型第29天10 7.31±0.58△△8.59±1.01*△2.65±0.90**4.77±1.22**△△5.63±0.63△△4.46±0.80**△△7.52±1.11**△△8.67±1.13模型第50天10 7.28±0.74△△8.88±0.93 3.81±0.69▲▲5.40±0.87*△△5.98±0.67△△5.26±0.61▲▲7.64±0.76**△△8.14±1.03空白組10 7.76±0.81 9.33±0.35 3.89±0.76 6.38±0.63 5 *△
表2 各組大鼠呼吸道菌群檢測結(jié)果比較(±s)
表2 各組大鼠呼吸道菌群檢測結(jié)果比較(±s)
注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型第8天比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型第29天比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。
.33±0.73 0.22±0.70 0.21±0.68 0.00±0.00模型第8天10 4.04±0.36 0.93±1.02**3.01±0.36*0.00±0.00 0.20±0.33 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型第29天10 2.94±0.56△△2.84±0.53△△1.93±0.44△△0.30±0.65 0.61±0.80 0.00±0.00 0.00±0.00 0.50±0.83模型第50天10 4.24±0.56▲▲3.18±0.52*△△2.80±0.30▲▲0.00±0.00 0.30±0.65 0.00±0.00 0.00±0.00 0.0產(chǎn)氣莢膜梭菌腸桿菌腸球菌乳酸桿菌雙歧桿菌空白組10 3.83±0.57 2.39±1.07 2.47±0.82 0.16±0.53 0組別例數(shù)需氧總數(shù) 厭氧總數(shù) 葡萄球菌0±0.00
3.3 腸道微生物定植抗力(B/E值)結(jié)果 見表3。與空白組比較,模型第8天組和模型第50天組腸道定植抗力顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型第8天比較,模型第29天組和模型第50天組腸道定植抗力顯著增強(P<0.05或P<0.01)。與模型第29天比較,模型第50天組的腸道定植抗力顯著降低(P<0.05)。
表3 各組大鼠的腸道微生物定植抗力(B/E值)比較(±s)
表3 各組大鼠的腸道微生物定植抗力(B/E值)比較(±s)
注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型第8天比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型第29天比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。
組別例數(shù)B/E值10 1.58±0.10模型第8天10 1.20±0.07**模型第29天10 1.55±0.24△△模型第50天10 1.37±0.23空白組*△▲
3.4 各時間點腸道菌群變化曲線 如圖1所示。各菌種在各時間點皆出現(xiàn)了變化。除葡萄球菌外,其余各菌種都在模型第8天時增多,到第29天時減少,第50天時又逐步增多。說明腸道菌群在受到腸道疾病影響的作用下,可出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),并隨著疾病時日的延長,出現(xiàn)腸道菌群的逐步調(diào)整變化。
圖1 腸道菌群變化曲線
3.5 各時間點呼吸道菌群的變化曲線 如圖2所示。腸病時,呼吸道主要出現(xiàn)變化的菌種是需氧總數(shù)、厭氧總數(shù)、葡萄球菌和腸桿菌。其中變化曲線趨勢一致的是需氧總數(shù)和葡萄球菌。都是在模型第8天增多,第29天減少,到第50天又增多。此趨勢與腸道的同一菌群變化趨勢具有一致性。
圖2 呼吸道菌群變化曲線
UC是一種以累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層的淺表性、非特異性炎癥為主要表現(xiàn)的消化道疾病,其發(fā)病被認為是宿主遺傳易感性、黏膜免疫與腸道菌群共同作用的結(jié)果,可能與腸道菌群失調(diào)、腸黏膜屏障功能缺陷、腸道通透性增高以及腸道內(nèi)成分誘發(fā)的異常免疫反應(yīng)等因素有關(guān)。國內(nèi)外研究一致表明,與正常人相比,UC患者普遍存在不同程度的腸道菌群失調(diào),腸道菌群的改變與UC起病、復發(fā)密切相關(guān),已成為廣泛共識[6-8]。
本研究結(jié)果顯示,UC大鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào),益生菌減少而條件致病菌增多,與國內(nèi)外同類研究結(jié)論一致。同時,模型大鼠呼吸道部分菌群也出現(xiàn)一定程度的相關(guān)變化。造模第8天,需氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多,厭氧總數(shù)和腸桿菌在腸道增多而在呼吸道減少。造模第29天,需氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步減少,厭氧總數(shù)和腸桿菌在腸道減少而在呼吸道增多;造模第50天,呼吸道和腸道的需氧總數(shù)、厭氧總數(shù)和葡萄球菌在呼吸道和腸道同步增多??梢?,當腸?。║C)時,部分肺、腸菌群可出現(xiàn)同步增多或同步減少,或在腸減少而在肺增多,或在腸增多而在肺減少的相關(guān)變化,提示肺、腸微生態(tài)菌群的變化可能是“腸病及肺”的途徑和表現(xiàn)形式之一。
腸道微生物定植抗力是指腸道內(nèi)源性專性厭氧菌抑制消化道中主要屬需氧菌的潛在致病菌群數(shù)量的能力,1971年由荷蘭微生物學家Van der waaij教授提出[9]。吳仲文和李蘭娟等[10-11]研究認為,糞便中雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比值(B/E值)可作為腸道微生物定植抗力指標應(yīng)用于臨床。B/E值大于1表示腸道定植抗力正常,B/E值小于等于1表示腸道定植抗力降低。本研究結(jié)果顯示,模型第8天大鼠腸道微生物定植抗力(B/E值)顯著下降,模型第29天B/E值逐漸恢復至正常狀態(tài),模型第50天B/E值略呈下降趨勢。提示腸?。║C)發(fā)病可直接導致腸道微生物定植抗力(B/E值)下降,引起嚴重的腸道菌群失調(diào)或紊亂,病程中腸道微生態(tài)可呈現(xiàn)自我恢復平衡的能力,腸道定植抗力趨于正常,由于病灶不除,隨著疾病時間延長,腸道定植抗力亦無法維持趨于正常的狀態(tài),定植抗力下降。
本研究初步發(fā)現(xiàn)UC大鼠出現(xiàn)腸道微生態(tài)改變,可伴隨出現(xiàn)呼吸道微生態(tài)的同步變化。今后研究尚可借助新一代454高通量測序技術(shù)等分子生物學方法,更準確地鑒定菌群,通過樣品細菌總基因組DNA的提取及其DNA基因測序技術(shù),更深入地探討“腸病及肺”病理傳變過程中呼吸道和腸道特異相關(guān)功能菌的作用機制。
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[2]盛益華,王新月,閆昕,等.從潰瘍性結(jié)腸炎大鼠肺損傷細胞凋亡機制探討“肺與大腸相表里”[J].世界華人消化雜志,2013,21(13):1171-1172.
[3]陳小兵,楊宇,唐宇嬌,等.“腸病及肺”動物模型的建立研究思路探討[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2012,33(2):7-9.
[4]楊瞿嘉.基于腸病模型大鼠病理改變及相關(guān)炎性因子的變化探討“腸病及肺”病理傳變機制[D].成都:成都中醫(yī)藥大學,2012.
[5]陳小兵.從“腸病”大鼠模型肺與結(jié)腸組織的病理形態(tài)及其VIP、SP、CGRP的表達探討“腸病及肺”的分子機制[D].成都:成都中醫(yī)藥大學,2012.
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(2014-03-11收稿 責任編輯:洪志強)
Exploration on the Interior-Exterior Relation Between Lung and Large Intestine from the Perspective of Synchronous Dynamic Change of Microecology of Respiratory and Intestinal Passage of Rats with Ulcerative Colitis
Zheng Xiuli,Yang Yu,Wang Baojia,Tang Hongqu,Zhou Xinying
(College of Basic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)
Objective:To explore the micro ecological mechanism of the TCM theory“l(fā)ung and large intestine are exteriorly and interiorly related”via observing the synchronous dynamic change of microecology of respiratory and intestinal passage of rats with ulcerative colitis.Methods:The ulcerative colitis rat models were created by TNBS(trinitro-benzene-sulfonic acid).We synchronously detected total aerobic bacteria,anaerobic bacteria,enterobacterium,enterococcus,staphylococcus,clostridium perfringens,bifidobacterium and lactobacillus in respiratory and intestinal passage on the 8th day,the 29th day and the 50th day aftermolding.Results:Dysbacteriosis appeared among the ratmodels including probiotics decreased and conditional pathogenic bacteria increased.Meanwhile,part of the respiratory floras of themodel rats also appeared certain relative changes.Aerobe total and staphylococcus synchronously increased both in lung and large intestine on the 8th daywhile anaerobe total and enterobacterium increased in intestine but decreased in lung.Aerobe total and staphylococcus synchronously decreased both in lung and large intestine at the 29th day while anaerobe total and enterobacterium decreased in intestine but increased in lung.Aerobe total,anaerobe total and staphylococcus synchronously increased both in lung and large intestine at the50th day.Conclusion:Ratswith enteropathy also can suffer from changes of respiratory floras.Parts of the respiratory and intestinal floras of rats with enteropathy appear synchronous changes during the process of enteropthy affected lung.Itmay increase or decreased synchronously.Changes in microbial floras can be one of the mechanisms and forms of“enteropathy affected lung”.
Ulcerative colitis;Exterior and interior relation of lung and large intestine;Enteropthy affected lung;Intestinal microecology;Respiratory microecology
R221;R256.1;R332
A
10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.006
國家重大基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號:2009CB522706)
鄭秀麗(1981—),女,博士,講師,E-mail:zhengxiuli023@163.com
楊宇(1953—),男,教授,博士生導師,E-mail:yang6666yu@163.com