文 屏 王建文 蔡珊珊

1.深圳市藥品檢驗(yàn)所，深圳 518057；2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006

UPLC法測定九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量

文 屏1王建文1蔡珊珊2

1.深圳市藥品檢驗(yàn)所，深圳 518057；2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006

目的 建立九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量測定方法，彌補(bǔ)該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不完善之處。 方法 采用ACQUITY BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為0.4 ml/min；檢測波長為203 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為1 μl。 結(jié)果 人參皂苷Rg1及三七皂苷R1分別在0.10～1.50 mg/ml，0.04～0.60 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好，平均回收率分別為99.4%、101.8%，RSD分別為0.5%、1.3%。 結(jié)論 該法方便、快速、準(zhǔn)確，適用于九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量測定，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

超高效液相色譜法；人參皂苷Rg1；三七皂苷R1；含量測定；質(zhì)量控制

三七（Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen）為五加科人參屬植物，具有顯著的活血化瘀、消腫止痛的功效，其主要活性成分為人參皂苷Rg1及三七皂苷R1，具有顯著的抗炎活血作用[1-3]，被廣泛應(yīng)用于各種中成藥中。2010年版《中華人民共和國藥典》（簡稱“中國藥典”）及其他相關(guān)文獻(xiàn)均以人參皂苷Rg1和三七皂苷R1作為三七質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[4-5]。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，有必要對中藥成方制劑中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量進(jìn)行質(zhì)量控制，建立準(zhǔn)確、可靠的檢驗(yàn)方法。九味肝泰膠囊收載于《中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)》上升國家標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)科肝膽分冊[6]。由三七、郁金、蒺藜、姜黃、大黃、黃芩、蜈蚣、山藥和五味子等9味中藥組成，具有化瘀通絡(luò)、疏肝健脾的作用，能治療慢性乙型肝炎及HBV攜帶者，能盡快改善癥狀，恢復(fù)體征，改善肝臟微循環(huán)，阻斷肝病慢性化發(fā)展，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)[7-8]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)主要涉及3個(gè)鑒別項(xiàng)目，分別是三七藥材、大黃（大黃素及大黃酚）、黃芩（黃芩苷）有關(guān)成分的鑒別以及大黃素含量測定項(xiàng)。目前，九味肝泰膠囊僅有關(guān)于大黃素、姜黃素以及黃芩苷等3個(gè)成分的HPLC含量測定的文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]，此外，還有采用TLC法對九味肝泰膠囊中的五味子醇甲進(jìn)行含量測定的報(bào)道[12]。目前全國共有2個(gè)生產(chǎn)廠家，2個(gè)藥品批準(zhǔn)文號(hào)。生產(chǎn)廠家均按現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。目前該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對于三七藥材僅建立了鑒別項(xiàng)目，尚無含量測定質(zhì)控項(xiàng)目。中國藥典2010年版一部對三七藥材中有效成分人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量測定方法采用HPLC，但檢測時(shí)間比較長。為了提高本品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，建立更加快速、高效的控制三七藥材投料情況的含量測定方法，本研究采用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC） 對該藥品中的人參皂苷Rg1及三七皂苷R1定量分析方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC超高液相色譜儀 （包括二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司生產(chǎn)）。METTLER-TOLEDO XS205電子分析天平 （十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1對照品 （中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)為：110704-201223，含量以93.4%計(jì)算，供含量測定用）；三七皂苷R1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110745-200617，供含量測定用）。九味肝泰膠囊 （湖南省新匯制藥有限公司，批號(hào)：120701、120702）；三七陰性藥材（按九味肝泰膠囊處方制備）；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITYBEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫（0～2 min：80%水；2～12 min：80%→81%水）；流速：0.4 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對照品約0.01 g，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，取三七皂苷R1對照品約0.01 g，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。用2 ml移液管轉(zhuǎn)移至20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得人參皂苷Rg1和三七皂苷R1混合對照品液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.5 g，精密稱定。精密加入甲醇25 ml，稱定重量，加熱回流1 h，放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻后濾過，精密取濾液10 ml，濾液蒸干，用15 ml水溶解，用乙醚萃取3次，每次30 ml，棄去乙醚層。用水飽和正丁醇萃取3次，每次30 ml，合并正丁醇液，正丁醇液用氨試液洗滌3次，每次30 ml，棄去堿水層，正丁醇液再用正丁醇飽和水洗滌3次，每次30 ml，分取正丁醇液，回收蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過（用 0.22 μm 濾膜），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按制備過程取除三七外的其余藥材，制成缺三七陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，供試品色譜圖中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的色譜峰能與其他成分很好地分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算＞4000，陰性樣品溶液在三七皂苷R1、人參皂苷Rg1色譜峰處均無干擾（圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 九味肝泰膠囊UPLC圖A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.三七皂苷 R1；2.人參皂苷 Rg1

分別精密吸取混合對照品溶液 0.2、0.5、1、2、3 μl，注入超高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到兩種成分的回歸方程。其中，人參皂苷 Rg1回歸方程 Y=7.12×105X+1.39×104，r=0.9999；三七皂苷 R1回歸方程 Y=6.47×105X+5.48×103，r=0.9999。 表明人參皂苷 Rg1在 0.10～1.50 mg/ml，三七皂苷R1在0.04～0.60 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取人參皂苷Rg1、三七皂苷R1混合對照品溶液 1 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，重復(fù)進(jìn)樣 6次。記錄人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的峰面積，其RSD值分別為0.4%、0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液（批號(hào)：120702）1 μl，分別于 0、4、8、10、24 h 進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分含量的 RSD值。結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD值分別為1.0%、0.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：120702）6份，分別精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備和“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算人參皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量，結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的RSD分別為1.7%和2.2%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的九味肝泰膠囊 （批號(hào)：120702，含人參皂苷Rg1和三七皂苷R1分別為4.23、0.84 mg/g）6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備和“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，并計(jì)算各組分回收率，結(jié)果提示，人參皂苷Rg1、三七皂苷R1的平均回收率分別為99.4%、101.8%，RSD分別為0.5%、1.3%（表1）。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

分別取相同廠家共 2批樣品（批號(hào)：120701、120702），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備和“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以外標(biāo)法進(jìn)行定量，計(jì)算三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑和量的選擇

九味肝泰膠囊屬于復(fù)方中藥制劑，處方含有九味中藥，如直接用甲醇等試劑提取，供試品成分較多，干擾嚴(yán)重，必須建立一個(gè)合適的提取方法。本試驗(yàn)提取方法是基于皂苷提取通則的基礎(chǔ)上，再加以補(bǔ)充而展開的。供試品制備方法即用甲醇溶劑加熱回流后，濾液用乙醚等極性小的有機(jī)溶劑脫脂、然后用水飽和的正丁醇萃取，再用氨試液洗滌除雜[13]，棄除黃酮類苷元等雜質(zhì)，對干擾成分如糖類等可采用加正丁醇飽和的水洗滌的方法除去。本研究在提取過程中進(jìn)行了比較，沒有進(jìn)行乙醚脫脂這一過程時(shí)，雜峰干擾嚴(yán)重，后對提取方法進(jìn)行改進(jìn)，用乙醚萃取脫脂后，雜質(zhì)峰干擾少，分離效果較好。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)樣品用甲醇提取加熱回流后，精密量取10 ml的濾液和全部濾液蒸干的提取效果不同，前者較后者雜質(zhì)峰較少，分離效果較好。

3.2 提取方法的選擇

本研究分別對索氏提取、大孔樹脂D101和加熱回流提取三種提取方式進(jìn)行考察。參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，大孔吸附樹脂有較強(qiáng)的吸附色素等雜質(zhì)的能力，可分離得到有效成分，能夠達(dá)到去粗取精的目的，但對被測成分有損失且耗費(fèi)時(shí)間長。索氏提取對于沸點(diǎn)較低溶劑如乙醚的提取率較高，但操作復(fù)雜。最終考察結(jié)果顯示索氏提取、大孔樹脂D101和加熱回流提取效果幾乎相同，故本試驗(yàn)最終采用簡便且提取率高的加熱回流方法提取。

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Determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule by UPLC

WEN Ping1WANG Jian-wen1CAI Shan-shan2
1.Shenzhen Institute for Drug Control in Guangdong Province,Shenzhen 518057,China;2.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China

ObjectiveTo establish an UPLC method for the content determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule.MethodsACQUITY BEH C18analytical column(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used with the mobile phase consisting of acetonitrile-water in gradient elution at a flow rate of 0.4 ml/min.The detection wavelength was 203 nm,column temperature was 35℃,and injection volume was 1 μl.ResultsGinsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule had good linearity within the range of 0.1-1.5 mg/ml and 0.04-0.6 mg/ml respectively,and their recoveries were 99.4%,101.8%,with RSD of 0.5%,1.3%respectively.ConclusionThe method is convenient,quick,correct for determination of ginsenoside Rg1and notoginsenoside R1in Jiuweigantai capsule,and can be used for the quality control for Jiuweigantai capsule.

Ultra performance liquid chromatography;Ginsenoside Rg1;Notoginsenoside R1;Content determination;Quality control

R927.2

A

1674-4721（2014）04（a）-0009-04

文屏（1982-），女，碩士，主管藥師，研究方向：中藥有效成分及中藥分析

2014-01-09 本文編輯：袁 成）