文 程 王 薇 何旭輝

輪狀病毒(rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，是引起人類急性腹瀉的主要病原體之一，并具有極強的傳染性。尤其A組RV是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉最常見的原因，全世界每年因輪狀病毒感染導(dǎo)致腹瀉的患兒大約有1．11億，其中死亡人數(shù)約有50萬左右［1］。VP7蛋白是位于RV外殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生中和抗體。根據(jù)RVVP7蛋白的特異性不同，可將RV分為不同的G血清型，至今已發(fā)現(xiàn)14個 G 血清型(G1～G14)［2］。因此，對某一地區(qū)流行的RV進(jìn)行G血清型鑒定，對了解當(dāng)?shù)豏V流行病學(xué)特征以及RV感染性腹瀉的預(yù)防與診治有非常重要的指導(dǎo)意義?，F(xiàn)對2009～2011年大慶市區(qū)各二級及以上醫(yī)院采集的288例腹瀉患者(其中兒童197例，成人91例)的腹瀉標(biāo)本進(jìn)行RV陽性鑒定，將鑒定為RV陽性的標(biāo)本利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行RVG血清型鑒定，以期通過了解大慶市RV的血清學(xué)特征，能為當(dāng)?shù)豏V的流行病學(xué)調(diào)查、RV感染性腹瀉的診治以及RV疫苗的選用起到指導(dǎo)作用。

材料與方法

1．主要試劑:膠回收試劑盒，小量質(zhì)粒提取試劑盒和RNA提取試劑盒、ExTaq DNA聚合酶、DNA marker DL 2000、DMSO、IPTG、pGEM-T Easy Vector，反轉(zhuǎn)錄酶AMV和dNTP購自大連寶生物公司;A組輪狀病毒ELISA檢測試劑盒購自O(shè)XOID公司。

2．輪狀病毒的ELISA檢測:將288例腹瀉標(biāo)本反復(fù)凍融3次后，用A組輪狀病毒ELISA試劑盒的稀釋液將腹瀉標(biāo)本稀釋成10%的懸液，10000r/min離心5min，利用A組輪狀病毒ELISA檢測試劑盒進(jìn)行RV陽性檢測。

3．一步多重RT-PCR鑒定RV血清型:①取處理過的標(biāo)本上清液200μl，按照Trizol Reagent試劑說明書提取輪狀病毒dsRNA;②參照GenBank上發(fā)表的各血清型人源RVVP7蛋白的基因序列，利用Oligo 6．0軟件設(shè)計上、下游引物;并經(jīng)DNA Star軟件證實其具有較好的特異性后，送上海生工生物技術(shù)有限公司合成;③取PCR反應(yīng)管依次加入RNA模板(2μl)、DEPC 水(3μl)、分型引物混合物(1．5μl)、DMSO(2μl)后，充分混勻，在97℃變性5min，迅速置冰浴上冷卻。向PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)所需的試劑。反應(yīng)條件設(shè)定為:42℃30min，94℃ 2min，94℃預(yù)變性1min，30 個循環(huán)(94℃變性30s，42℃退火2min，72℃延伸1min)，最后72℃延伸1min。反應(yīng)完畢，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

4．一步法RT-PCR擴(kuò)增RVVP7基因全長片段:參照GenBank上發(fā)表的人源輪狀病毒VP7蛋白的序列(Access number:K02033)，利用Oligo 6．0軟件設(shè)計一對特異性引物(上游引物:5'-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-3';下游引物:5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3')。通過一步法RT-PCR擴(kuò)增RVVP7基因全長片段。反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

5．目的片段的測序及分析［3］:用Geneaid膠回收試劑盒回收和純化DNA，將膠回收純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并序列的分析。

結(jié) 果

1．腹瀉標(biāo)本的RV陽性檢測結(jié)果:A組輪狀病毒ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示，288例腹瀉標(biāo)本中有177例為RV陽性，其中兒童152例，成人19例。

2．一步多重RT-PCR結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在749bp、652bp、374bp位置上分別出現(xiàn)了特異的DNA條帶，這3條帶與 G1、G2、G3型 VP7基因的理論值相一致(圖1)。由此得出，177例RV陽性標(biāo)本中有73例為 G1型 (41．2%)，12例為 G2型(6．7%)，67 例為 G3型 (37．9%)。此外，還出現(xiàn)了25例 G1與 G3混合型(14．1%)。

圖1 RVVP7基因型別RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

3．一步法RT-PCR結(jié)果:對177例RV陽性標(biāo)本的VP7基因全長進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，均在在1062bp處出現(xiàn)一條特異條帶(圖2)，與RVVP7基因全長的理論值一致。

圖2 VP7基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

4．RVVP7目的片段測序及序列比對結(jié)果:對177例RV陽性標(biāo)本的RVVP7編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行分析、比對，結(jié)果見圖3。有73例核苷酸序列同源性＞96．5%，且與G1型人輪狀病毒W(wǎng)a株的VP7核苷酸序列同源性≥95．7%;12例核苷酸序列同源性＞95．2%，與 G2型人輪狀病毒 S2株的 VP7核苷酸序列同源性≥93．3%;67例核苷酸序列同源性＞95．5%，與G3型人輪狀病毒SY9株的VP7核苷酸序列同源性≥92．5%;25例核苷酸序列同源性＞91．3%，與G1和G3混合型人輪狀病毒P53株的核苷酸序列同源性≥90．5%。根據(jù)最新提出的VP7核苷酸序列同源性＞80%為同一基因型的原則，可進(jìn)一步確定177例RV陽性的腹瀉標(biāo)本中，G1型73例，G2型為12例，G3型67例為;25例為G1和G3混合型［3］。

圖3 輪狀病毒陽性標(biāo)本VP7血清型分析

討 論

輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，多呈散發(fā)性，3歲以前幾乎所有兒童都曾感染過輪狀病毒，早產(chǎn)兒、低出生體重兒及免疫缺陷患兒更容易患病。此外，約50%接觸過RV感染患者的成人也可獲得感染。現(xiàn)已證明，在世界范圍內(nèi)，導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的RV血清型主要為G1～G4型［4］。而且，這幾種血清型之間存在著一定的交叉重組現(xiàn)象。此外，一些比較罕見的RV血清型如G9型、G5型已在某些國家地區(qū)呈流行趨勢，我國個別地區(qū)如北京、上海等地的RV流行株中也出現(xiàn)了G9型［5～8］，這說明 RV流行株在世界范圍內(nèi)正呈現(xiàn)更為復(fù)雜的多樣性。不同國家或同一國家的不同地區(qū)，RV血清型的分布均存在差異。即使同一地區(qū)的不同年份，RV血清型也可能存在差異。因此，對某地區(qū)輪狀病毒VP7血清型的流行特點進(jìn)行調(diào)查，獲取可靠的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，對RV感染性腹瀉的診治及指導(dǎo)RV疫苗研制與選用都將起到十分重要的作用。

本研究通過RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對大慶地區(qū)感染人的RV血清型做了一次流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，288例腹瀉患者中有177例為RV陽性。其中，197例兒童腹瀉患者的標(biāo)本中有152例RV陽性，陽性率為77．1%，91例成人腹瀉患者，有19例為RV陽性，陽性率為20．9%。由此可見，成人RV陽性率明顯低于兒童，說明RV主要侵襲免疫系統(tǒng)發(fā)育未完全的兒童，而成人對RV的感染有一定的抵抗力，所以發(fā)生率較低，符合RV流行病學(xué)特征。此外，本研究得出的兒童腹瀉患者的RV陽性率稍高于其他地區(qū)，主要是因為本研究采集標(biāo)本的時間多集中在秋冬季，腹瀉患兒的年齡主要為5歲以下，這與其他國家報告的5歲以下患兒的RV感染率在60%～80%相一致［9］。RV血清型鑒定結(jié)果顯示大慶地區(qū)近3年來流行的A組RV主要以G1型和G3型為主，分別占41．2%和37．9%，同時也存在少數(shù)的G2型。這與有關(guān)報道的中國其他地區(qū)輪狀病毒血清型的檢測結(jié)果多以G1和G3型為主是一致的，說明本地區(qū)流行的RV并未見新血清型的出現(xiàn)［10］;但與武漢、杭州等地區(qū)的主要RV流行株的血清型存在一些差異，說明我國各地區(qū)間RV的流行情況是有差異的，可能考慮與氣候、環(huán)境等因素有關(guān)［11～13］。本研究同時發(fā)現(xiàn)有25例為G1和G3混合型，說明RV毒株在大慶地區(qū)已存在重組變異，這提醒我們在制定RV預(yù)防策略以及RV疫苗株的選用與研制上，應(yīng)充分考慮當(dāng)?shù)豏V的變異情況。本研究對大慶市區(qū)內(nèi)感染人的RV血清型進(jìn)行了鑒定，由于采集的標(biāo)本在時間、區(qū)域等方面的局限性以及技術(shù)上的不成熟，可能會導(dǎo)致結(jié)果存在一定的誤差，但為進(jìn)一步開展大慶市嬰幼兒輪狀病毒腹瀉的分子流行病學(xué)調(diào)查提供了必要的參考資料，同時也能為RV疫苗的選用提供可靠的理論依據(jù)。

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