喻光懋 吳云路 錢 穎 董學(xué)君

肺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生率逐年增加，其療效一般均較差，除手術(shù)難以清除外，術(shù)后化療耐藥是重要原因。腫瘤化療耐藥尚無(wú)理想的對(duì)策，其重要原因在于耐藥機(jī)制及重要分子不甚明了，因此是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)于通過(guò)損傷DNA來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞的藥物，其耐藥性與DNA損傷修復(fù)相關(guān)分子及其表達(dá)有關(guān)，并得到普遍認(rèn)同。Mus81和GEN1是近年被發(fā)現(xiàn)的與DNA修復(fù)相關(guān)的新基因。李嬋媛等［1］報(bào)道，Mus81在喉癌中表達(dá)下調(diào)，并認(rèn)為Mus81下調(diào)與喉癌發(fā)生具有顯著相關(guān)性。本研究組以往對(duì)乳腺癌的研究結(jié)果表明，乳腺癌患者病灶組織Mus81表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，有研究發(fā)現(xiàn)Mus81表達(dá)異常與耐藥性相關(guān)［2］。Turnbull等［3］報(bào)道，GEN1基因在乳腺癌病灶組織和相應(yīng)癌旁組織表達(dá)無(wú)顯著差異。而Kuligina等［4］認(rèn)為，GEN1突變是乳腺癌易感的隱性標(biāo)志。

由此可見(jiàn)，Mus81和GEN1基因在部分腫瘤中表達(dá)有特異性改變，并顯示其改變與化療耐藥相關(guān)，但肺癌中的相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究目的是了解肺癌組織中，Mus81和GEN1是否與其他腫瘤一樣有表達(dá)上的改變，并探討其對(duì)肺癌診斷和治療的潛在臨床價(jià)值及二者表達(dá)是否存在相關(guān)性。

材料與方法

1．材料:(1)臨床資料:收集肺癌患者手術(shù)標(biāo)本30例(包括病灶組織和相應(yīng)的癌旁組織)。所有標(biāo)本均來(lái)源于筆者醫(yī)院心胸外科，肺癌患者年齡41～80歲，平均年齡64歲。患者術(shù)前均未經(jīng)放化療，病理診斷均經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診。(2)主要儀器:NANO DROP2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Anthos 2010酶標(biāo)儀購(gòu)自英國(guó)Anthos公司，瓊脂糖電泳儀購(gòu)自上海復(fù)日科技公司，凝膠電泳成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，定性PCR儀、Western blot電泳儀電源、垂直電泳儀、轉(zhuǎn)移電泳槽均購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司。(3)主要試劑:E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit購(gòu)自美國(guó)Omega公司，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Biomiga公司，β-actin、Mus81、GEN1上下游引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成，β-actin鼠抗人一抗、Mus81鼠抗人一抗、GEN1兔抗人一抗、HRP兔抗鼠二抗、HRP羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光A、B液購(gòu)自上海Beyotime公司。

2．方法:(1)標(biāo)本處理:標(biāo)本用裝有一次性無(wú)菌袋的0℃保溫瓶收集，收集后20min內(nèi)用生理鹽水沖洗、分裝，并立刻置于液氮中速凍，之后迅速轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)Mus81和GEN1 mRNA達(dá)表的檢測(cè):1)組織總RNA的抽提:取大約500mg新鮮組織加入液氮充分研磨后，按說(shuō)明書加入 E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取組織總RNA。提取出的總RNA用Thermo NANO DROP2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，OD260/OD280在1．8～2．0之間為最佳。2)RT-PCR:按照cDNA第一鏈合成試劑盒(Biomiga)說(shuō)明書，將5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行 PCR反應(yīng)。所用引物序列如下:Mus81上游引物:5'-TGTGGACATTGGCGAGAC-3'，下游引物:5'-GCTGAGGTTGTGGACGGA-3'(產(chǎn)物長(zhǎng)度319bp);GEN1上游引物［5］:5'-CCACATGACTATGAATACTGCTGTCCTT-3'，下游引物:5'-TGGGAATCCCTCACAACAGCAAGC-3'(產(chǎn)物長(zhǎng)度116bp);β-actin上游引物:5'-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3'，下游引物:5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'(產(chǎn)物長(zhǎng)度 108bp)。PCR 反應(yīng)體系 20μl，包括 Taq MasterMix 10μl、上下游引物各1μl、cDNA 1μl、去離子水 7μl。PCR 反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性90s，然后 94℃30s、55℃30s、72℃1min，30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 終延伸5min。取5μl PCR終產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。使用ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行灰度掃描、Quantity One-4．6．2分析結(jié)果。以同一標(biāo)本Mus81以及GEN1基因mRNA條帶與內(nèi)參基因β-actin mRNA條帶的光密度比值作為該基因的相對(duì)表達(dá)量。(3)Mus81和GEN1基因蛋白表達(dá)的檢測(cè):取新鮮組織約500mg按照說(shuō)明書加入 E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取組織總蛋白。使用Anthos 2010酶標(biāo)儀結(jié)合Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio)測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整每孔蛋白上樣量，使每孔總蛋白量保持一致。100V恒壓，SDS-PAGE電泳2h;300mA恒流，轉(zhuǎn)膜1h。轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅染液(Solarbio)染色5min，蒸餾水洗去殘留染液。1×TBST洗膜5分/次×3次后，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，1×TBST洗膜15分/次×3次，然后分別加入β-actin鼠抗人抗體(1∶3000，Abcam)、Mus81 鼠抗人抗體(1∶1000，Abcam)、GEN1羊抗兔抗體(1∶75，Abcam)，4℃孵育過(guò)夜。棄一抗，1×TBST洗膜15分/次×3次。β-actin和Mus81組加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶10000，Abcam)，GEN1組加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶20000，Abcam)，室溫孵育1h。棄二抗，1×TBST洗膜15分/次 ×3次。最后滴加ECL化學(xué)發(fā)光A、B液(Beyotime)，曝光、顯影、定影。使用ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描、Quantity One-4．6．2分析結(jié)果，以同一標(biāo)本Mus81以及GEN1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的光密度比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17．0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。t檢驗(yàn)比較癌組織、癌旁組織Mus81及GEN1表達(dá)量的差異。Spearman相關(guān)分析檢測(cè)Mus81和GEN1表達(dá)水平的相關(guān)性。所有檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．肺癌病灶組織及癌旁組織Mus81 mRNA和蛋白的表達(dá):在肺癌組織中，Mus81 mRNA的平均相對(duì)表達(dá)量(0．365 ±0．098)低于相應(yīng)癌旁組織(0．455 ±0．123)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3．529，P ＜0．05)(圖1、圖3)。Mus81蛋白平均相對(duì)表達(dá)量(1．046±0．121)低于相應(yīng)癌旁組織(1．341 ±0．190)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4．273，P ＜0．05，圖2、圖4)。

2．肺癌病灶組織和癌旁組織GEN1 mRNA和蛋白的表達(dá):肺癌組織中，GEN1 mRNA的平均相對(duì)表達(dá)量(0．420 ±0．111)與相應(yīng)癌旁組織(0．455 ±0．123)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2．006，P ＞0．05，圖1、圖3)。GEN1蛋白平均相對(duì)表達(dá)量(0．769±0．188)同相應(yīng)癌旁組織(0．719±0．148)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．957，P ＞0．05，圖2、圖4)。

圖1 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 mRNA表達(dá)水平

圖2 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1蛋白表達(dá)水平

圖3 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 PCR電泳結(jié)果

3．肺癌Mus81和GEN1表達(dá)的相關(guān)性:Spearman相關(guān)分析得出，30例肺癌組織中，Mus81表達(dá)水平和GEN1表達(dá)水平無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(P＞0．05)，但在Mus81高表達(dá)的6例肺癌組織中，Mus81的表達(dá)水平和GEN1的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

討 論

現(xiàn)有的研究認(rèn)為，Mus81是一種抑癌基因，其編碼的蛋白屬于XPF核酸內(nèi)切酶家族，在DNA修復(fù)及分解霍利迪連接體上具有重要作用［6］。本組30例肺癌病灶組織及癌旁組織的對(duì)照研究結(jié)果，Mus81 mRNA表達(dá)，肺癌病灶組織顯著低于癌旁組織(P＜0．05)，Mus81蛋白表達(dá)的結(jié)果也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，表明Mus81可能與肺癌的發(fā)生相關(guān)。Mus81具有DNA修復(fù)功能，因此推測(cè)可能的機(jī)制為Mus81表達(dá)下調(diào)降低了對(duì)正常細(xì)胞損傷DNA的修復(fù)，細(xì)胞不能及時(shí)識(shí)別處理受損DNA，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，這與己明確DNA損傷可致癌的理論相符。喉癌、乳腺癌、肺癌中均見(jiàn)到類似結(jié)果，提示Mus81表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生可能是不同腫瘤的共同現(xiàn)象，但具體的機(jī)制尚不明確，因此，進(jìn)一步了解Mus81在細(xì)胞中的作用機(jī)制，對(duì)了解腫瘤的發(fā)生過(guò)程具有十分重要意義。

圖4 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 Western blot結(jié)果

近年研究發(fā)現(xiàn)，GEN1作為XPG家族的新成員，具有分解霍利迪連接體，進(jìn)而保證DNA順利修復(fù)的功能，并且GEN1和Mus81存在著密切關(guān)系，兩者共同影響細(xì)胞中霍利迪連接體的分解及DNA修復(fù)［7，8］。Wood 等［9］運(yùn)用“基因組地形”技術(shù)，發(fā)現(xiàn) 2例乳腺癌患者的GEN1基因存在突變，并認(rèn)為GEN1可能是一種新的抑癌基因。Turnbull等［3］通過(guò)分析乳腺癌患者以及對(duì)照組GEN1的表達(dá)認(rèn)為，GEN1的表達(dá)情況和乳腺癌的發(fā)生沒(méi)有明顯關(guān)系。與此不同，Kuligina等［4］認(rèn)為，GEN1在單側(cè)乳腺癌患者的體內(nèi)表達(dá)較對(duì)照組高(P=0．031)，但雙側(cè)乳腺癌患者同對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尚未發(fā)現(xiàn)GEN1在肺癌中表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道。鑒于GEN1和Mus81存在著密切關(guān)系，為此本研究進(jìn)行這二基因的聯(lián)合分析，結(jié)果顯示，GEN1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，在肺癌和相應(yīng)的癌旁組織中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)論和Turnbull等［3］的報(bào)道相一致，提示在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，GEN1的作用可能并不是主要的，而之前也有學(xué)者認(rèn)為GEN1作為Mus81的替代基因而存在［10］。本研究30例肺癌組織中，Mus81和GEN1的表達(dá)沒(méi)有明顯的相關(guān)性，可能的原因是Mus81和GEN1之間，尚有其他中間相關(guān)因子發(fā)揮作用。但是在Mus81高表達(dá)的6例肺癌組織中，Mus81的表達(dá)水平和GEN1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，這一結(jié)論或許可以從側(cè)面證明Mus81和GEN1共同影響著細(xì)胞DNA的修復(fù)［8］。

綜上所述，肺癌組織中Mus81的表達(dá)低于癌旁組織，提示Mus81的表達(dá)下調(diào)可能和肺癌的發(fā)生有關(guān);結(jié)合之前相關(guān)報(bào)道，提示Mus81表達(dá)下調(diào)可能是不同腫瘤普遍存在的現(xiàn)象;GEN1在肺癌組織中的表達(dá)水平同癌旁相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示GEN1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中并未起主要作用。Mus81表達(dá)水平和GEN1表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性。本研究觀察到Mus81異常表達(dá)與乳腺癌化療耐藥相關(guān)，但在肺癌中的相關(guān)性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 李嬋媛，王淑云，袁海明，等．Mus81基因在喉癌中的突變和表達(dá)［J］．中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2008，25(5):560-565

2 錢穎，張帆，倪曉妍，等．Mus81基因在乳腺癌中的表達(dá)及其意義［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30(6):1313

3 Turnbull C，Hines S，Renwick A，et al．Mutation and association analysis of GEN1 in breast cancer susceptibility［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，124(1):283-288

4 Kuligina ES，Sokolenko AP，Mitiushkina NV，et al．Value of bilateral breast cancer for identification of rare recessive at-risk alleles:evidence for the role of homozygous GEN1 c．2515_2519delAAGTT mutation［J］．Fam Cancer，2013，12(1):129-132

5 Wechsler T，Newman S，West SC．Aberrant chromosome morphology in human cells defective for Holliday junction resolution［J］．Nature，2011，471(7340):642-646

6 Agmon N，Yovel M，Harari Y，et al．The role of Holliday junction resolvases in the repair of spontaneous and induced DNA damage［J］．Nucleic Acids Res，2011，39(16):7009-7019

7 Ishikawa G，Kanai Y，Takata K，et al．DmGEN，a novel RAD2 family endo-exonuclease from Drosophila melanogaster［J］．Nucleic Acids Res，2004，32(21):6251-6259

8 Rass U，Compton SA，Matos J，et al．Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein［J］．Genes Dev，2010，24(14):1559-1569

9 Wood LD，Parsons DW，Jones S．The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers［J］．Science，2007，318(5853):1108-1113

10 Ho CK，Mazón G，Lam AF，et al．Mus81 and Yen1 promote reciprocal exchange during mitotic recombination to maintain genome integrity in budding yeast［J］．Mol Cell，2010，40(6):988-1000