暢艷娜 李偉君 孫少伯 劉 凱 李應(yīng)東

阿霉素(ADR)是臨床上一種常見(jiàn)的高效抗腫瘤藥物，其主要不良反應(yīng)以心臟毒性較多見(jiàn)，且呈劑量依賴(lài)性，所以在一定程度上限制了該藥在臨床上的長(zhǎng)期應(yīng)用。中藥當(dāng)歸有效成分具有清除自由基、抗氧化、抗心律失常、改善心肌細(xì)胞代謝活動(dòng)等作用［1～3］。本實(shí)驗(yàn)以阿霉素誘導(dǎo)Wistar乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞建立損傷模型，用不同濃度的當(dāng)歸超濾物進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)阿霉素致乳鼠心肌細(xì)胞損傷的作用及可能機(jī)制。

材料與方法

1．材料:(1)實(shí)驗(yàn)藥物:當(dāng)歸超濾物由蘭州佛慈制藥廠與甘肅省膜科所聯(lián)合制備。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新生1～3天SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄不拘，由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):scxk(甘)2011-0001。(3)試劑和儀器:DMEM培養(yǎng)基、HamF12培養(yǎng)基(Sigma公司產(chǎn)品)，阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，H33021980)，四氮唑藍(lán)(MTT)(華美生物工程公司產(chǎn)品)，LDH試劑盒(南京建成生物工程公司)，Ca2+-ATP酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20120714)，caspase-3(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，2104658)，caspase-12(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，2103812)。

2．方法:(1)心肌細(xì)胞原代培養(yǎng):心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，取新生1～3天Wistar乳大鼠(雌雄兼用)，在無(wú)菌的條件下，取出心臟，將心肌組織剪成約1mm3大小，加入0．04%的胰蛋白酶消化2次，37℃水浴，振蕩10min，換用0．05%的Ⅱ型膠原酶消化，37℃水浴，振蕩8min，直至組織塊消化完全［4］。收集除前2次以外的消化液移入離心管，加等量的完全培養(yǎng)基終止消化，離心機(jī)離心10min，1000r/min，用完全培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞沉淀，培養(yǎng)于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。1．5h后差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)于5%CO2培養(yǎng)箱中。36～48h換液1次，培養(yǎng)48～72h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞成長(zhǎng)過(guò)程，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行照相。(2)實(shí)驗(yàn)分組:正常對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)48h后換液1次，加含與藥物組等體積生理鹽水的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h;阿霉素?fù)p傷模型(ADR損傷模型)組，常規(guī)培養(yǎng)48h換液，加含濃度為5μg/ml阿霉素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h;當(dāng)歸超濾物不同濃度處理ADR+當(dāng)歸組，取低、中、高(3．75、7．5、15g/L)濃度分別加入培養(yǎng)基中孵育48h后換液，加含濃度為5μg/ml阿霉素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。(3)細(xì)胞活性檢測(cè):于96孔板培養(yǎng)心肌細(xì)胞，密度105個(gè)/孔，每孔細(xì)胞懸液100μl。經(jīng)處理后每孔加入 MTT100μl，37℃ 孵育 4h后，移棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl，振蕩10min，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，所測(cè)OD值可定量反映活細(xì)胞數(shù)量。(4)LDH含量測(cè)定:各組細(xì)胞經(jīng)處理后，收集上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用2，4-二硝基苯肼顯色法，在可見(jiàn)分光光度計(jì)上通過(guò)比色法檢測(cè)LDH含量。(5)Ca2+-ATP酶活性測(cè)定:各組細(xì)胞經(jīng)處理后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化后棄上清，留下層細(xì)胞，加入PBS液稀釋成107/cm3的細(xì)胞懸液，置于EP管中，用超聲破碎細(xì)胞。制備好的細(xì)胞懸液在測(cè)試前搖勻取樣200～300μl。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞活性。(6)Western blot測(cè)心肌細(xì)胞caspase-3、caspase-12蛋白含量［5］:用預(yù)冷的PBS漂洗心肌細(xì)胞，單去污劑裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)(冰上操作)，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度。分別取5μl蛋白量經(jīng)SDS PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況。5%脫脂奶粉封閉1h，后與caspase-3、caspase-12抗體4℃孵育過(guò)夜。β-actin作為內(nèi)標(biāo)，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 37℃孵育1h，加ECL發(fā)光試劑孵育1min，在暗室將膜在感光膠片上曝光并用相紙顯影洗像。結(jié)果用Alpha Imager 2200圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，分別計(jì)算caspase-3、caspase-12與β-actin灰度比值代表其相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1．心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:見(jiàn)圖1。

圖1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)(×100)

2．當(dāng)歸超濾膜提取物對(duì)ADR損傷乳鼠心肌細(xì)胞MTT的影響:結(jié)果見(jiàn)表1，與正常對(duì)照組比較，ADR損傷組心肌細(xì)胞的存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);與ADR損傷模型組相比，當(dāng)歸超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞存活率均明顯升高(P＜0．05)。

表1 不同劑量當(dāng)歸對(duì)ADR心肌細(xì)胞損傷后細(xì)胞存活率的影響(±s)

表1 不同劑量當(dāng)歸對(duì)ADR心肌細(xì)胞損傷后細(xì)胞存活率的影響(±s)

與正常對(duì)照組比較，#P＜0．05;與ADR損傷模型組比較，*P＜0．05

組別ADR濃度(μg/ml) 當(dāng)歸濃度 心肌細(xì)胞存活率(%)正常對(duì)照組 0 0μg/ml 100．1 ±0．047 ADR 損傷模型組 5 0μg/ml 41．8 ±1．311#ADR+ 當(dāng)歸低劑量組 5 3．75g/L 49．3 ±0．483*ADR+ 當(dāng)歸中劑量組 5 7．5g/L 58．9 ±1．271*ADR+當(dāng)歸高劑量組 5 15g/L 69．8±2．355*

3．當(dāng)歸超濾膜提取物對(duì)ADR損傷乳鼠心肌細(xì)胞LDH的影響:與正常對(duì)照組比較，ADR損傷后心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義性(P＜0．05)。與ADR損傷模型組相比，當(dāng)歸超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH有不同程度的降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。與ADR損傷模型組相比，高劑量當(dāng)歸超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，詳見(jiàn)表2。

表2 不同劑量當(dāng)歸對(duì)ADR損傷心肌細(xì)胞LDH活性的影響(±s)

表2 不同劑量當(dāng)歸對(duì)ADR損傷心肌細(xì)胞LDH活性的影響(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0．01;與ADR損傷模型組相比較，#P＜0．01

酶活性正常對(duì)照組 0 0μ組別ADR濃度(μg/ml) 當(dāng)歸濃度 LDH g/ml 28．00 ±2．620 ADR 損傷模型組 5 0μg/ml 46．05 ±3．468*ADR+ 當(dāng)歸低劑量組 5 3．75g/L 44．63 ±2．787 ADR+ 當(dāng)歸中劑量組 5 7．5g/L 44．46 ±2．186 ADR+當(dāng)歸高劑量組 5 15g/L 38．04 ±2．904#

4．當(dāng)歸超濾膜提取物對(duì) ADR損傷心肌細(xì)胞Ca2+-ATP酶活性的影響:結(jié)果見(jiàn)表3，與正常對(duì)照組比較，ADR損傷后心肌細(xì)胞中Ca2+-ATP酶活性明顯下降，差異有顯著性(P＜0．05);與ADR損傷模型組相比，當(dāng)歸超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞中Ca2+-ATP酶活性有不同程度的升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。

表3 不同劑量當(dāng)歸組的鈣離子ATP酶活性(±s)

表3 不同劑量當(dāng)歸組的鈣離子ATP酶活性(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05;與ADR損傷模型組比較，#P＞0．05

g/ml 100 ±0．894 ADR 損傷模型組 5 0μg/ml 41．47 ±1．553*ADR+當(dāng)歸低劑量組 5 3．75g/L 49．69 ±1．870#ADR+當(dāng)歸中劑量組 5 7．5g/L 62．09 ±2．453#ADR+當(dāng)歸高劑量組 5 15g/L 66．03±1．255酶活性正常對(duì)照組 0 0μ組別ADR濃度(μg/ml) 當(dāng)歸濃度 Ca-ATP#

5．蛋白印跡法測(cè)定各組心肌細(xì)胞 caspase-3、caspase-12蛋白含量的表達(dá):結(jié)果見(jiàn)圖2，與正常對(duì)照組比較，ADR損傷組心肌細(xì)胞caspase-3、caspase-12的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0．05)。與ADR損傷模型組比較，當(dāng)歸超濾膜提取物干預(yù)組心肌細(xì)胞caspase-3、caspase-12表達(dá)水平不同程度下調(diào)，高劑量當(dāng)歸組caspase-3下調(diào)差異具有著性(P＜0．05);低中高劑量當(dāng)歸組caspase-12下調(diào)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

圖2 各組心肌細(xì)胞caspase-3、caspase-12蛋白的表達(dá)

討 論

阿霉素(ADR)是臨床上一種常見(jiàn)的高效抗腫瘤藥物，屬蒽環(huán)類(lèi)藥物。目前認(rèn)為蒽環(huán)類(lèi)抗癌藥的心臟毒性分為兩種類(lèi)型:一是急性心臟毒性，不良反應(yīng)包括心律失常，一般在用藥后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)，為暫時(shí)性可逆性改變;另外一種為慢性心臟毒性，常見(jiàn)特征包括充血性心力衰竭和心肌病，發(fā)生率以及毒性都與用藥劑量有關(guān)，為不可逆改變;病死率為30% ～60%。張三典［6］在研究阿霉素心臟毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，阿霉素濃度在0．31～10．00μg/ml范圍內(nèi)均能抑制心肌細(xì)胞活性，并具有很強(qiáng)的劑量和時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。同時(shí)，心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該酶與阿霉素濃度大小呈正相關(guān)，并呈濃度與時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。尋找一種能有效緩解阿霉素心臟毒性的藥物但又不影響其抗腫瘤療效的藥物尤為迫切。

中醫(yī)理論認(rèn)為，在化療中由阿霉素所引起的各種不良反應(yīng)其根本原因在于“邪之所湊，其氣必虛”，反過(guò)來(lái)本病的發(fā)生是由于體質(zhì)虛弱、正氣不足，復(fù)感溫?zé)岵⌒?，溫度之邪入侵，?nèi)舍于心，損傷心之肌肉、內(nèi)膜所致。因此從扶正的角度入手是研究減毒增敏藥物的關(guān)鍵思路。國(guó)內(nèi)外許多臨床試驗(yàn)研究證實(shí)扶正中藥對(duì)阿霉素所引起的心臟毒性療效顯著。本實(shí)驗(yàn)所用的當(dāng)歸是傳統(tǒng)的活血化瘀藥，中醫(yī)早已明確其具有增加組織血流量，減小氧耗，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)合成，改善心肌氧供，緩解急性心肌缺血，保護(hù)缺血心肌的作用［7，8］。正如清代《本草經(jīng)百種錄》所說(shuō):“當(dāng)歸為血家必用之藥，實(shí)為養(yǎng)血之要品”。現(xiàn)代研究對(duì)當(dāng)歸有了新的認(rèn)識(shí)。它含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、微量元素等多種物質(zhì)，能顯著促進(jìn)機(jī)體造血功能，升高紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血紅蛋白含量;抑制血小板凝聚，抗血栓，調(diào)節(jié)血脂;抗心肌缺血、心律失常，擴(kuò)張血管，降低血壓;調(diào)節(jié)子宮平滑肌。還能增強(qiáng)免疫、抗炎、保肝、抗輻射、抗氧化和清除自由基等。楊靜微等［9］研究表明，當(dāng)歸還可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，已被廣泛用于血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及其腫瘤的治療。

MTT可被活細(xì)胞吸收，并在線粒體被還原成藍(lán)紫色的顆粒，測(cè)定標(biāo)本藍(lán)紫色顆粒溶解后的值，可定量反映活細(xì)胞數(shù)量。LDH系胞質(zhì)酶，正常情況下不能透過(guò)細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，LDH會(huì)從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)漏出，培養(yǎng)液中LDH增多，測(cè)定培養(yǎng)液中LDH濃度可反映心肌細(xì)胞的損傷情況［10，11］。Ca2+-ATP 酶本身對(duì)于 ATP 的合成有著十分重要的作用，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷時(shí)，其表達(dá)量就會(huì)減少［12］。caspase-3、caspase-12 蛋白是細(xì)胞凋亡途徑中誘發(fā)表達(dá)的兩個(gè)重要蛋白質(zhì)分子。ADR本身可以激活FAS以及FASL的蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步的激活caspase-8最終激活caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)使得細(xì)胞開(kāi)始凋亡。

當(dāng)歸多種主要成分如揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸類(lèi)化合物、氨基酸具有抗氧化損傷、阻止細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，ADR損傷組細(xì)胞存活率明顯下降，培養(yǎng)液中LDH濃度明顯上升，鈣離子-ATP酶活性明顯降低，caspase-3、caspase-12蛋白表達(dá)上調(diào)。與ADR損傷組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞存活率明顯上升，培養(yǎng)液中LDH濃度明顯下降，鈣離子-ATP酶活性明顯升高，caspase-3、caspase-12蛋白表達(dá)下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示當(dāng)歸超濾物具有拮抗ADR致心肌細(xì)胞損傷的作用，其機(jī)制與其增強(qiáng)細(xì)胞ATP酶活性、降低細(xì)胞內(nèi)LDH釋放、抑制凋亡因子釋放有關(guān)，為其防治ADR致心肌損傷應(yīng)用提供了一定依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是益氣活血中藥在化療中具有減毒增敏效應(yīng)的有利佐證。

1 劉穎．淺議當(dāng)歸的化學(xué)成分與臨床藥理作用［J］．中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，8(27):51-52

2 倪竹南，呂圭源，樓招歡．當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(7):93-94

3 仇平，張端蓮．當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后FAK表達(dá)的研究［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，2010，23(1):28-30

4 Mussi SV，Silva RC，Oliveira MC，et al．New approach to improve encapsulation and antitumor activity of doxorubicin loaded in solid lipid nanoparticles［J］．EurJ Pharm，2013，48(1):282-190

5 王桂敏，翟宏穎．菟絲子黃酮對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠Bcl-2、Caspase-3 表達(dá)的影響［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32(2):343-345

6 張三典．阿霉素與X射線對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心間細(xì)胞損傷的初步實(shí)驗(yàn)研究［D］．蘇州:蘇州大學(xué)，2005

7 劉微．阿霉素心臟毒性中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制及抗凋亡的研究進(jìn)展［J］．中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘:兒科學(xué)，2007，26(3):193

8 謝玲，楊凌紅，李曉惠．當(dāng)歸藥理作用研究進(jìn)展［J］．中醫(yī)藥研究，2000，16(6):56-58

9 楊靜薇，歐陽(yáng)靜萍，廖維靖，等．當(dāng)歸對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷保護(hù)作用的研究［J］．中國(guó)病理生理雜志，2000，10:36-38

10 Lei X，Chen Y，Du G，et al．Gossypol inducesBax/Bak-independent activation of apoptosis and cytochrome c release via a conformational change in Bcl-2［J］．FASEB J，2006，20(12):2147-2149

11 Hu X，Jiang H，Ma F，et al．Similarities between ischemic preconditioning and postconditioning in myocardial ischemia/reperfusioninjuiy［J］．Int J Cardiol，2010，144(1):135-136

12 Kang YJ，Zhou ZX，Wang GW，et al．Suppression by metallothionein of doxorubicin induced cardiomyocyte apoptosis through inhibition of p38 mitogen activated protein kinases［J］．J Biol Chem，2000，275:13690-13698