劉海燕 曹海濤 常玉梅 徐 鵬

1.解放軍第252醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2.解放軍第252醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河北保定 071000

腹瀉是一種常見病，引起腹瀉的原因有多種，大致可分為感染性腹瀉和非感染性腹瀉，其中感染型腹瀉占比較高。感染性腹瀉常見的病原菌包括細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲等，其中又以細(xì)菌感染為主要感染類型，尤其是在成人腹瀉中發(fā)生率高。人體菌群失調(diào)與腹瀉可能存在著某種程度上的因果關(guān)系，不同類型的腹瀉可能對(duì)應(yīng)著程度不同的菌群數(shù)量變化[1-3]。臨床上目前大多采用傳統(tǒng)的腸道菌群分析方法，需要不同的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)，然后進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，多種病原菌需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件，培養(yǎng)操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且大多數(shù)微生物不能很好地培養(yǎng)出來，容易造成假陰性和數(shù)量上的偏差，沒有成熟的方法完整準(zhǔn)確地反映腸道微生物群落的組成情況，采用熒光定量PCR、ERIC-PCR指紋圖譜法等分子生態(tài)學(xué)的方法可有效解決這個(gè)問題[4-5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

糞便有白細(xì)胞患者（腹瀉組）及正常對(duì)照者（對(duì)照組），糞便樣品為2013年7～9月采自解放軍第252醫(yī)院門診部。腹瀉組選自門診消化科就診的腹瀉患者，對(duì)照組選自門診體檢人員，均采自就診當(dāng)日，所有樣品采集后立即提取基因組DNA，-20℃冷凍保存。所有患者留取糞便標(biāo)本前均未應(yīng)用抗生素或微生態(tài)制劑。對(duì)照組留取糞便標(biāo)本前2周內(nèi)無消化道不適癥狀，且未應(yīng)用抗生素或微生態(tài)制劑。患者資料見表1。

表1 兩組一般資料情況

1.2 主要儀器及試劑

糞便基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green熒光染料試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，DNA純化試劑盒、DNA Marker、瓊脂糖、PCR 2×PCR Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)所需引物為北京天一輝遠(yuǎn)合成，PCR儀為美國伯樂公司的MyCycler，熒光定量PCR儀為美國AB公司的ABI 7500。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本前處理及細(xì)菌DNA的抽提 稱取2 g糞便加入18 mL無菌PBS，振蕩10 min形成糞漿，均勻吸取0.2 g糞漿標(biāo)本用DNA緩沖液處理，間歇振蕩1 min至樣本混勻。取上清200 μL，加入1.4 mL緩沖液 GSL，70℃孵育 5 min， 渦旋 15 s，12000 r/min 離心1 min。轉(zhuǎn)移上清液1.2 mL至新的2 mL離心管，加入15 μL蛋白酶K，然后加入緩沖液GB，渦旋片刻后70℃孵育10 min。加入200 μL無水乙醇，渦旋混勻后加入吸附柱，12 000 r/min離心30 s后棄去廢液，再用不同濃度漂洗液漂洗3次，待吸附柱在室溫放置30 min后，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μL洗脫緩沖液，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中，即為糞便標(biāo)本中的細(xì)菌總DNA。

1.3.2 DNA濃度及純度的檢測(cè) 將DNA渦旋片刻，吸取2 μL于Thermo multiskan go酶標(biāo)儀的微量板的滴樣孔處，以吸附緩沖液作為空白對(duì)照，每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)重復(fù)，260 nm/280 nm波長處檢測(cè)吸光度，測(cè)定細(xì)菌總DNA濃度與純度，再取5 μL總DNA行1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V 30 min后于凝膠成像儀觀察DNA條帶情況。

1.3.3 PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌、腸球菌16S rDNA基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer premier 5.0設(shè)計(jì)并參考文獻(xiàn)制訂PCR引物。見表2。

表2 腸道菌群與ERIC-PCR所需引物序列

1.3.4 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉各0.2 g，用1 mL PBS溶解，振蕩混勻后吸取200 μL，按照DNA提取試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟提取標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA，并用相應(yīng)的引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化后回收，測(cè)量純化后標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA OD值，計(jì)算雙鏈DNA的濃度，得到PCR片段的拷貝數(shù)并換算為各標(biāo)準(zhǔn)品1 μL的拷貝數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：雙歧桿菌屬為 2.3×1014拷貝/μL，乳酸桿菌屬為 1.8×1014拷貝/μL，大腸埃希菌屬為 5.8×1014拷貝/μL，糞腸球菌為2.6×1014拷貝/μL。然后做10倍系列稀釋，使之成為1×102～1×108拷貝/mL，作為定量 PCR 標(biāo)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，橫坐標(biāo)代表不同陽性模板細(xì)菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)代表出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)（Ct值）。

1.3.5 熒光定量PCR將待測(cè)糞便樣品純化的DNA分別進(jìn)行3種細(xì)菌的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)，采用20 μL反應(yīng)體系。熒光染料SYBR premix（2×）9 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL， 模板 DNA 2 μL，ddH2O 7 μL，最后加入石蠟油 8 μL。 擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，雙歧桿菌57℃，乳酸桿菌58℃，大腸埃希菌59℃，糞腸球菌60℃退火30 s，68℃延伸 30 s，循環(huán) 40 次，74℃后延伸 1 min。 每次反應(yīng)每個(gè)樣品做1個(gè)復(fù)孔，以標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA做陽性對(duì)照，ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)完畢后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的Ct值，得出樣品中4種細(xì)菌的拷貝數(shù)。最后根據(jù)融解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

1.3.6 ERIC-PCR 反應(yīng)體系為25 μL，DNA模板終濃度為80ng；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性7min，95℃變性1min，52℃退火 1 min，65℃延伸 8 min， 循環(huán) 30次，65℃后延伸10 min。反應(yīng)完畢后于1%瓊脂糖凝膠電泳，80 V，30 min，凝膠成像儀檢查條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，菌群所測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA濃度與純度

DNA濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，各DNA濃度為200～600 ng/μL，OD260/OD280比值為 1.8～2.2，濃度及純度可以作為PCR后續(xù)使用。部分DNA凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 糞便標(biāo)本DNA電泳結(jié)果

2.2 熒光定量PCR

與對(duì)照組相比，腹瀉組患者糞便中的雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），大腸埃希菌、腸球菌屬數(shù)量無明顯變化（P＞0.05）。兩組研究對(duì)象的糞便定量結(jié)果見表3。

表3 糞便標(biāo)本細(xì)菌定量結(jié)果（拷貝/g，±s）

表3 糞便標(biāo)本細(xì)菌定量結(jié)果（拷貝/g，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05

8.85±0.57 8.28±0.68△8.36±0.45 7.79±0.39△8.41±0.38 8.40±0.50 7.49±0.65 7.56±0.42雙歧桿菌屬 乳酸桿菌屬 大腸埃希菌 腸球菌屬對(duì)照組腹瀉組30 30組別 例數(shù)

2.3 ERIC-PCR

ERIC-PCR指紋圖譜條帶的多少與微生物種群數(shù)量呈正相關(guān)，條帶的敏感程度顯示該片段的DNA片段數(shù)量。由圖2可見，與對(duì)照組比較，腹瀉組患者ERIC-PCR結(jié)果條帶明顯減少，且小片段居多，多集中在某些特定的片段周圍，甚至特定區(qū)域的條帶多于對(duì)照組相應(yīng)區(qū)域，在1500 bp以上的區(qū)域條帶很少。見圖2。

3 討論

糞檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)被廣泛地用于臨床上對(duì)感染性和非感染性腹瀉的初步診斷，而且對(duì)于門診患者以糞檢有無白細(xì)胞區(qū)分感染性和非感染性腹瀉的診斷是可靠的。在腹瀉類型中，兒童腹瀉以輪狀病毒感染居多。本實(shí)驗(yàn)主要研究細(xì)菌感染類型的腹瀉，所以將研究對(duì)象設(shè)為18歲以上的成年人[6]，進(jìn)行腸道微生態(tài)分析。臨床上多采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，需要很長的時(shí)間去獲得純培養(yǎng)物，但往往得到的結(jié)果卻不是很理想，如獲得純培養(yǎng)的細(xì)菌比例較少，甚至大量的細(xì)菌不能得到培養(yǎng)和鑒定。目前認(rèn)為，以細(xì)菌特異性基因序列分析的分子生物學(xué)方法是很可靠的技術(shù)，結(jié)果理想且時(shí)間快，能很好地應(yīng)用于臨床[7-8]。本實(shí)驗(yàn)室使用非可培養(yǎng)方法對(duì)腹瀉組和對(duì)照組的腸道菌群進(jìn)行了分析，用熒光定量PCR方法對(duì)4種代表腸道菌群的菌種做了定量研究，用ERIC-PCR法進(jìn)行腸道菌群總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過樣品ERIC條帶的分布分析腸道樣品中菌群結(jié)構(gòu)的特征，研究對(duì)象為腸道內(nèi)菌群的總和。這兩種分子生態(tài)學(xué)方法均比較快速、簡潔，適合在臨床上應(yīng)用推廣。

圖2 糞便菌群總DNA的ERIC-PCR指紋圖譜分析

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。人體腸道內(nèi)的微生物中，超過99%都是細(xì)菌，存活數(shù)量大約有10×106個(gè)，有500～1000個(gè)不同的種類。這些數(shù)目龐大的細(xì)菌大致可以分為3大類：有益菌、有害菌和中性菌。人體是否健康與腸道內(nèi)的益生菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。腸道菌群在長期的進(jìn)化過程中，通過個(gè)體的適應(yīng)和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環(huán)境之間，始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，形成一個(gè)互相依存、相互制約的系統(tǒng)。因此，人體在正常情況下，菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)宿主表現(xiàn)為不致病[9-12]。通常研究腸道菌群主要有大腸埃希菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌4個(gè)種群，當(dāng)某種外界條件刺激或者機(jī)體發(fā)生病理改變的時(shí)候，菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)的改變[13-16]。雙歧桿菌、乳酸桿菌為有益菌的代表。雙歧桿菌、腸球菌為常駐菌群代表。本實(shí)驗(yàn)的腹瀉研究顯示，腹瀉患者糞便中的雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量明顯減少，屬于有益菌數(shù)量降低，大腸埃希菌、腸球菌屬數(shù)量無明顯變化，整體上說明存在菌群失調(diào)現(xiàn)象。菌群失調(diào)尤其是益生菌的減少，影響著機(jī)體內(nèi)能量、脂肪和氨基酸的代謝，對(duì)維持機(jī)體代謝平衡起著重要作用。菌群失調(diào)和多種原因的腹瀉有著密切關(guān)系。SYBR GreenⅠ是一種可以和雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，在定量PCR過程中，由于不斷地與新的PCR產(chǎn)物結(jié)合，形成的熒光信號(hào)也越來越強(qiáng)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法可以得到定量結(jié)果，相對(duì)于探針法簡單、節(jié)約經(jīng)費(fèi)，在引物特異性較好的情況下可以準(zhǔn)確得到混合菌群中各菌株的數(shù)量，應(yīng)用于菌群的定量研究。

ERIC序列是首先在腸道細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)的非編碼保守重復(fù)序列，被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)或者種間各類微生物的鑒定，也有越來越多的研究者用來分析混合菌群的群落結(jié)構(gòu)，得到能夠反映菌群組成差異的重復(fù)性好而又穩(wěn)定的圖譜。ERIC序列作為一種長引物RAPD技術(shù)，應(yīng)用到研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)，具有重復(fù)性好、簡便、快速和靈敏度高的特點(diǎn)，可以有效地同時(shí)分析不同生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)差異以及動(dòng)態(tài)地檢測(cè)同一生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的結(jié)構(gòu)變化。ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于混合微生物的研究中，在研究土壤、活性污泥、腸道菌群等復(fù)雜微生物菌群中可以分析出微生物群落的組成特征[17-19]。本研究通過ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)分析糞檢有白細(xì)胞的腹瀉患者及健康對(duì)照者腸道樣品，比較腹瀉與健康個(gè)體腸道菌群結(jié)構(gòu)的整體差異，研究腹瀉對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，糞檢白細(xì)胞的患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常人腸道菌群存在著很大的差異。首先得到的結(jié)論是腹瀉患者腸道內(nèi)擴(kuò)增條帶范圍小而集中在較小片段，暗示著該組菌群多樣性明顯減少。

本研究用DNA熒光定量PCR法和ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)對(duì)腹瀉人群與對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)，比較腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化情況。這兩種方法直接檢測(cè)微生物的基因組DNA，用DNA的種類組成代表細(xì)菌的種類組成，可以比較客觀、全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)中優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)變化，不僅克服了傳統(tǒng)方法只能檢測(cè)少部分種類的局限性，而且縮短了分析時(shí)間，提高了分析精度，還能夠?qū)Υ罅繕悠愤M(jìn)行并行分析，使得系統(tǒng)檢測(cè)腸道菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)隨環(huán)境變化而變化的規(guī)律成為可能。

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