羅 勁 陳一強 孔晉亮 鄔麗紅 黃 宏

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，廣西南寧 530021

煙曲霉是導致臨床免疫力低下患者肺部真菌感染的常見病原體之一。近年來雖然新型抗曲霉菌藥物的研發(fā)取得了一定的進展，但唑類耐藥和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，使煙曲霉感染的患者病死率依舊很高。體外研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜形成是煙曲霉產(chǎn)生耐藥的重要機制之一，且生物被膜一旦成熟，其耐藥性將提高幾十、幾百甚至上千倍[1]，控制難治性煙曲霉感染成為當前臨床治療上面臨的一大難題。因此若能夠?qū)で笠环N能夠有效破壞已經(jīng)形成的煙曲霉生物被膜的藥物或方法，或?qū)⒂兄诮鉀Q這一難題。金銀花主要抗真菌活性成分為綠原酸和異綠原酸[2-3]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能破壞銅綠假單胞菌及煙曲霉生物被膜[4-5]，而目前異綠原酸對生物被膜相關(guān)生物學作用罕有報道，因此本實驗旨在探究異綠原酸對不同時期煙曲霉生物被膜的體外作用，為控制生物被膜藥物的研發(fā)在原料選擇方面提供更多科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2012年5月~2013年9月臨床分離煙曲霉共31株，用結(jié)晶紫染色法測定成膜能力，選取成膜能力最強煙曲霉菌株（編號為A.f4）為實驗菌株。質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019由我院臨床微生物檢驗鑒定中心提供。

1.2 主要試劑

異綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號111782-201204）以最大溶解度溶解于二甲基椏楓（DMSO，Solarbio公司），0.22 μm 濾器濾過后于-20℃保存；結(jié)晶紫粉末（天津紅巖試劑廠）溶解于滅菌去離子水配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的結(jié)晶紫染液；RMPI-1640粉（Gibico 公司）；3-（N-嗎啉基）丙磺酸-4-嗎啉丙磺酸（MOPS，美國 Sigma 公司）；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability死活菌染色試劑盒（Invitrogen公司）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，中國路橋技術(shù)責任有限公司）；分析純無水乙醇（天津Kermel化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉（美國 sigma公司）。

1.3 儀器

圓形玻璃細胞爬片（直徑13 mm，天津博泰克科技公司）作為構(gòu)建生物被膜的載體，高壓滅菌備用；生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司BHC-1300IIA/B2）；智能生化培養(yǎng)箱（常州市偉嘉儀器制造有限公司 SPX250）；酶標儀（美國 Thermo Multiskan MK3）；掃描電鏡（日立SU8020）；激光共聚焦顯微鏡（CLSM，Nikon A1）。

1.4 方法

1.4.1 孢子懸液的制備 將受試的煙曲霉菌株A.f4接種至PDA斜面，37℃恒溫復蘇3 d后，轉(zhuǎn)種于另一PDA培養(yǎng)基37℃活化3 d，用5 mL含0.025%Tween-20的PBS沖洗斜面收集孢子，20 mL MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×105個/mL，作為建立煙曲霉體外靜止生物被膜模型的孢子懸液。

1.4.2 異綠原酸的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MFC）測定 參照美國臨床實驗室標準協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）M38-A2 絲狀真菌藥敏指南[6]并做適當調(diào)整，測定異綠原酸對受試菌株A.f4及質(zhì)控菌株的MIC和MFC。其中異綠原酸最終受試濃度為 2~1024 μg/mL（1024 μg/mL 為最大溶解度，且各濃度含DMSO終體積分數(shù)≤1%）。

1.4.3 體外煙曲霉靜止生物被膜模型的建立 參考Mowat等[7]的方法，往無菌24孔板各孔加入1個滅菌生物被膜載體及1 mL制備好的孢子懸液，靜置于生化培養(yǎng)箱，分別于37℃恒溫孵育24 h和48 h，在載體上形成早期、成熟期煙曲霉生物被膜。培養(yǎng)期間每隔24小時更換1次RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.4.4 CLSM檢測經(jīng)異綠原酸作用后不同時期生物被膜內(nèi)死活菌 建模后，異綠原酸組加入1024 μg/mL的異綠原酸，空白對照組則加入RPMI-1640培養(yǎng)液；加藥前各孔分別用滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次除去未黏附菌。藥物作用48 h（期間每隔24小時用相同的液體換液1次）后將載體取出，以滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次。按照LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability試劑盒的使用說明，將碘化丙啶（PI）及Syto-9熒光染料按1∶1比例配制好后用滅菌去離子水稀釋500倍，取200 μL加入各孔沒過載體，室溫避光染色15 min，無菌PBS輕輕漂去未黏附染料，自然干燥后置于CLSM下放大200倍觀察。

1.4.5 SEM觀察異綠原酸對不同時期生物被膜的形態(tài)干預 建模、分組同CLSM。藥物作用48 h（期間每隔24小時分別用相同的液體換液）后將載體取出，滅菌PBS輕輕漂去載體表面的浮游菌，2.5%戊二醛固定24 h，依次用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水并干燥后，真空噴鍍金粉，于20 kV電壓、放大2000倍條件下進行掃描電鏡（SEM）形態(tài)學觀察。

1.4.6 結(jié)晶紫染色法對不同濃度異綠原酸作用于不同時期生物被膜后的定量分析 按照上述方法建模后，用滅菌PBS輕輕漂洗生物被膜表面3次以去除未黏附菌。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果將實驗分為：空白對照組、不同濃度異綠原酸組（64、128、256、512、1024 μg/mL），異綠原酸組加入上述濃度的藥物，空白對照組加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液。藥物作用48 h（期間每隔24 h各組分別用相同的液體換液），取出各組載體，參照Peeters等[8]及Shao等[9]的方法并做適當改進：滅菌PBS緩沖液輕輕漂去生物被膜表面的浮游菌，室溫干燥后將載體置于新的24孔板中，加入1%結(jié)晶紫1 mL染色15 min。再次輕輕漂洗生物被膜表面未黏附的結(jié)晶紫，室溫干燥后加入1 mL無水乙醇脫色10 min。吸取100 μL洗脫液加入96孔板，酶標儀570 nm波長測定各孔吸光度值（A570），以無水乙醇作為空白對照。各組每次分別設(shè)置3個副孔取其平均值，實驗獨立重復3次。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 異綠原酸的MIC和MFC測定結(jié)果

根據(jù)CLSI M38-A2絲狀真菌藥敏指南判讀標準，異綠原酸對受試煙曲霉A.f4菌株及質(zhì)控菌株的MIC和MFC均大于1024 μg/mL。

2.2 各組CLSM檢測結(jié)果比較

成熟期煙曲霉生物被膜內(nèi)菌絲密度較早期更為密集。無論早期或成熟期，藥物作用48 h后，空白對照組和異綠原酸組生物被膜內(nèi)的菌絲均以具有活力的綠色為主，幾乎沒有出現(xiàn)紅色死亡狀態(tài)的菌絲。見圖 1（封三）。

2.3 SEM觀察結(jié)果

2.3.1 對早期煙曲霉生物被膜破壞作用 空白對照組的菌絲大部分被黏稠的胞外基質(zhì)包裹使之相互黏附形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，僅能隱約看到部分菌絲輪廓，見圖2（A）；經(jīng)異綠原酸作用后，胞外基質(zhì)明顯減少，菌絲輪廓飽滿，清晰可見，見圖2（B）。

2.3.2 異綠原酸對成熟期煙曲霉生物被膜破壞作用與早期相比，成熟期的生物被膜結(jié)構(gòu)更加致密。空白對照組煙曲霉菌絲表面完全被濃密厚實的胞外基質(zhì)包裹，幾乎看不到菌絲的輪廓，見圖2（C）；異綠原酸組的菌絲表面雖然仍有殘留少量的胞外基質(zhì)，但相對于同時期空白對照組而言，胞外基質(zhì)已經(jīng)明顯減少，菌絲輪廓更為清晰，見圖2（D）。

2.4 結(jié)晶紫染色法對異綠原酸作用于不同時期生物被膜后的定量結(jié)果

無論早期或成熟期的生物被膜，當異綠原酸作用濃度達 256 μg/mL 及以上時，即 256、512、1024 μg/mL異綠原酸組的A570值與同期空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；64、128 μg/mL 異綠原酸組的A570值與同期空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義 （P ＞ 0.05）；256、512、1024 μg/mL 異綠原酸組 A570值兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即隨著異綠原酸濃度增加，生物被膜減少更明顯；濃度低于256 μg/mL異綠原酸組對載體上生物被膜量影響與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

圖2 不同時期煙曲霉生物被膜形態(tài)學（SEM，2000×）

表1 異綠原酸作用于不同時期煙曲霉生物被膜后結(jié)晶紫染色法定量結(jié)果比較（x±s，n=3）

具有成膜能力的煙曲霉臨床分離菌株在體外培養(yǎng)24 h后，可獲得由多層菌絲有序排列形成具有復雜三維立體結(jié)構(gòu)特征的多細胞菌落，即早期生物被膜，48 h后生物被膜逐漸成熟即成熟期生物被膜[10-11]。生物被膜形成以后，煙曲霉對常用抗真菌藥物如兩性霉素B及其脂質(zhì)體、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈、米卡芬凈等抗真菌藥的敏感性均下降[12]，且生物被膜越成熟，包裹在生物被膜內(nèi)的菌體耐藥性越明顯。胞外基質(zhì)是構(gòu)成生物被膜的基礎(chǔ)物質(zhì)，其主要成分為多糖（半乳糖甘露聚糖，α-1，3-葡聚糖）、單糖、多元醇、疏水蛋白及各種抗原等。胞外基質(zhì)帶負電荷，可以吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈，從而形成一道疏水屏障，阻礙親水性抗真菌藥物滲入菌體發(fā)揮殺菌作用[13]。隨著煙曲霉生物被膜的成熟或在唑類藥物誘導條件下，多耐藥蛋白（MDR4）等多耐藥基因表達會明顯上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄翻譯出的MDR能介導菌體對藥物的外排作用，降低細胞膜通透性，從而減少抗真菌藥物在菌體內(nèi)的蓄積量[14]。煙曲霉次級代謝產(chǎn)物膠霉毒素隨著生物被膜的形成和成熟，產(chǎn)生量不斷增加，使煙曲霉菌體得以避開宿主免疫系統(tǒng)的攻擊并長期在宿主體內(nèi)生存[15]，這可能也是其發(fā)生耐藥的機制之一。

金銀花是清熱解毒中藥，其活性成分綠原酸類主要包括綠原酸（單咖啡?？鼘幩幔┖彤惥G原酸（二咖啡?？鼘幩幔哂畜w外抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用。綠原酸類物質(zhì)的抗真菌機制主要與其立體結(jié)構(gòu)和棘白菌素類抗真菌藥物結(jié)構(gòu)具有相似性有關(guān)[2，16-17]。異綠原酸在金銀花活性成分中的構(gòu)成比僅次于綠原酸，化學結(jié)構(gòu)比綠原酸多一個咖啡?；?，兩者同屬于苯丙素類化合物。本研究以最大溶解度的異綠原酸稀釋100倍（1024 μg/mL）后作用于煙曲霉早期及成熟期生物被膜，CLSM觀察到生物被膜內(nèi)的菌絲仍有活力，說明亞抑菌濃度的異綠原酸對菌絲本身沒有直接殺菌作用。SEM及結(jié)晶紫染色法定量結(jié)果證實異綠原酸可以使包裹菌絲的胞外基質(zhì)明顯減少，且隨著其濃度增高（≥256 μg/mL），生物被膜減少愈顯著，即異綠原酸能夠抑制或降解胞外基質(zhì)，破壞不同時期的煙曲霉生物被膜結(jié)構(gòu)，其作用呈濃度依賴性。異綠原酸對成熟期生物被膜破壞作用不如早期生物被膜明顯，這可能與成熟期生物被膜培養(yǎng)周期更長，胞外基質(zhì)更濃厚，藥物作用時間不足或菌體對藥物外排作用隨生物被膜成熟而增強有關(guān)，其具體機制有待進一步研究；可以推測，若能在生物被膜形成的早期階段，用異綠原酸干預胞外基質(zhì)形成或破壞其結(jié)構(gòu)，減弱生物被膜屏障作用，并聯(lián)合使用抗真菌藥物，可增強藥物的滲透并在菌體內(nèi)達到有效蓄積量，從而發(fā)揮其殺菌活性，同時還能減輕大劑量應(yīng)用抗真菌藥物給機體帶來的毒副作用，解決當前治療生物被膜相關(guān)感染在藥物選擇方面捉襟見肘的現(xiàn)狀。本課題組后期將通過進一步聯(lián)合抗真菌藥物實驗來證實這一猜想。異綠原酸主要來源于金銀花，其產(chǎn)地遍布全國各省，原材料豐富，取材便利，若能應(yīng)用于臨床治療煙曲霉生物被膜相關(guān)感染，將極大降低藥物成本，節(jié)約醫(yī)療費用，增加經(jīng)濟效益。本實驗結(jié)論進一步拓展了中藥金銀花活性成分的功效范圍，使其臨床醫(yī)療應(yīng)用前景更加廣闊。

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