趙亞榮，張文羿，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

0 引 言

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能夠發(fā)酵乳糖生成乳酸的細(xì)菌，且在自然界中分布廣泛。作為益生菌的乳酸菌對(duì)人體健康起著至關(guān)重要的作用，與此同時(shí)，作為重要的工業(yè)微生物，乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)物已被廣泛應(yīng)用于食品、藥物、飼料和精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域[1-3]。但乳酸菌在其生產(chǎn)和應(yīng)用中都不可避免的面臨著多種環(huán)境脅迫。在發(fā)酵過(guò)程中，由于乳酸的大量積累和氧的存在對(duì)乳酸菌造成酸脅迫和氧脅迫；在乳酸菌冷凍干燥過(guò)程中，由于極低的環(huán)境溫度對(duì)乳酸菌造成冷脅迫；在人體胃腸道應(yīng)用過(guò)程中，膽鹽的存在以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏均會(huì)對(duì)乳酸菌造成一定程度的脅迫。這些脅迫環(huán)境會(huì)明顯導(dǎo)致乳酸菌生理狀況的惡化，進(jìn)而影響其發(fā)酵和代謝產(chǎn)物的生成。因此，了解乳酸菌在不同環(huán)境脅迫下的分子機(jī)制，對(duì)更好的利用乳酸菌具有實(shí)際的指導(dǎo)意義。

1 細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)

面對(duì)環(huán)境的突變，細(xì)菌會(huì)做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)，從而更益于其在自然界中生存。如同其它細(xì)菌，乳酸菌對(duì)脅迫環(huán)境的敏感性及其所具有的抵御該環(huán)境的能力，使得其可以忍受惡劣的生存環(huán)境。理論上，細(xì)菌的每一個(gè)基因都具有特定的調(diào)節(jié)功能，并且能在一定的環(huán)境中進(jìn)行表達(dá)。其中有些功能是受多個(gè)基因調(diào)節(jié)的，細(xì)菌對(duì)于環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)便是一個(gè)很好的例子。Stortz等證實(shí)細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)主要是依靠基因的共同表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過(guò)程 (細(xì)胞分裂，DNA代謝，看家基因表達(dá)，細(xì)胞膜的合成以及運(yùn)輸?shù)?，從而提高細(xì)菌的抗環(huán)境脅迫能力[4]。

適應(yīng)性反應(yīng)是乳酸菌應(yīng)激反應(yīng)中最常見(jiàn)的現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中，由適應(yīng)性反應(yīng)所誘導(dǎo)的保護(hù)作用可保護(hù)細(xì)胞抵御更為惡劣的條件，從而有效提高乳酸菌的存活率。而交互保護(hù)作為另一種應(yīng)激反應(yīng)，在提高乳酸菌脅迫條件下的存活率和改進(jìn)工藝性質(zhì)方面具有重要作用。薛峰等研究了不同預(yù)適應(yīng)條件對(duì)干酪乳桿菌 ATCC393存活的影響，研究結(jié)果表明，分別經(jīng)熱、酸、過(guò)氧化氫和膽鹽預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞均能誘導(dǎo)交互保護(hù)作用[5]。乳酸菌脅迫機(jī)理的研究一方面能進(jìn)一步挖掘成熟菌株的應(yīng)用潛力，同時(shí)也為篩選具有高脅迫抗性的優(yōu)良菌株提供了可借鑒的思路。

2 乳酸菌環(huán)境脅迫機(jī)理

目前，對(duì)乳酸菌環(huán)境脅迫機(jī)制的研究主要包括酸脅迫、冷脅迫、膽鹽脅迫、氧脅迫以及營(yíng)養(yǎng)脅迫。研究益生菌環(huán)境脅迫機(jī)制需要一個(gè)特定的綜合系統(tǒng)，其研究方法包括傳統(tǒng)生物學(xué)手段、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及代謝組學(xué)。其中，蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)菌在環(huán)境脅迫條件下應(yīng)激機(jī)理的最可靠手段，此方法可分析在特定的時(shí)間和條件下，一個(gè)細(xì)胞或生物樣品中所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[6]。O＇Farrell等提出的雙向凝膠電泳法(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)[7]。此前，蛋白質(zhì)組學(xué)僅是用于對(duì)蛋白質(zhì)的分離，利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，從而分離出蛋白質(zhì)。而現(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學(xué)為研究乳酸菌在脅迫環(huán)境中的生理反應(yīng)提供了新的借鑒和思路。

2.1 酸脅迫

乳酸菌可發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，從而降低生長(zhǎng)環(huán)境的pH，而pH的變化會(huì)對(duì)菌體的發(fā)酵能力和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生一定影響，值得關(guān)注的是，乳酸菌在食品加工過(guò)程中所遇到的酸抑制和在通過(guò)人體胃腸道時(shí)所經(jīng)歷的低pH環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制是不同的[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，低pH環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生各種分子伴侶、酶以及氨基酸，這些物質(zhì)會(huì)參與其酸應(yīng)激，并對(duì)菌體在酸應(yīng)激過(guò)程中維持pH動(dòng)態(tài)平衡以及細(xì)胞的修復(fù)具有重要作用。Sanchez等研究了長(zhǎng)雙歧桿菌在低pH環(huán)境中的應(yīng)答和適應(yīng)性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在此環(huán)境中，與糖酵解相關(guān)的一些酶被誘導(dǎo)合成，其中α-1,4-糖苷酶，磷酸葡萄糖變位酶和UDP-4-葡萄糖異構(gòu)酶均被上調(diào)[9]。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種 (Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)在低pH值環(huán)境中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在酸脅迫下也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的分子伴侶(GroES，GroEL，HrcA，GrpE，DnaK，DnaJ，ClpE，ClpP，ClpL) 以及與脂肪酸合成相關(guān)的基因(fabH，accC，fabI)，而使類異戊二烯合成的甲羥戊酸途徑的基因(mvaC,mvaS)受到抑制[10]，從而幫助菌體來(lái)適應(yīng)該脅迫環(huán)境。在對(duì)干酪乳桿菌Lactobacillus casei Zhang的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)天冬氨酸也參與了酸脅迫的耐受性。實(shí)驗(yàn)以野生菌株做為對(duì)照進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在pH3.5的條件下變異株細(xì)胞內(nèi)的天冬氨酸和精氨酸的含量均高于野生菌株，表明天冬氨酸和精氨酸可提高菌體對(duì)酸的耐受性[11]。

2.2 膽鹽脅迫

乳酸菌對(duì)膽鹽耐受能力的大小是檢驗(yàn)其在人體腸道中能否存活的指標(biāo)之一。膽鹽具有殺菌作用，它不僅可以破壞細(xì)胞膜，而且還會(huì)使DNA氧化受損。乳酸菌可產(chǎn)生膽鹽水解酶 (Bile Salt Hydrolases，BSH)將膽鹽進(jìn)行解共軛，同時(shí)使類固醇物質(zhì)水解成為氨基酸或?；撬?，此水解酶可以改變膽鹽的特性，從而大大降低其在低pH環(huán)境中的溶解性。在高膽鹽環(huán)境中，各種相關(guān)酶的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化。Yokota等首次研究證明乳酸菌和雙歧桿菌的膜蛋白與膽鹽脅迫具有密切的關(guān)系，該膜蛋白可以使膽鹽從細(xì)胞中流出[12]。采用蛋白質(zhì)組學(xué)觀察長(zhǎng)雙歧桿菌在膽鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)許多與雙歧分流相關(guān)酶的表達(dá)上調(diào)[13]。在動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)中發(fā)現(xiàn)此類與膽鹽耐受相關(guān)的酶均參與了該菌株糖類的代謝。而且，參與菌體細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的相關(guān)蛋白質(zhì)也受到膽鹽的影響，這可能是與細(xì)胞內(nèi)部的NADH和FAD+的濃度有關(guān)系。

烏日娜等對(duì)L.casei Zhang在1.5%膽鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有26種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了變化，如細(xì)胞膜保護(hù)蛋白、代謝關(guān)鍵酶等[14]。當(dāng)乳酸菌處于膽鹽脅迫環(huán)境中時(shí)，利用2-DE法對(duì)其蛋白質(zhì)學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)中分別有23個(gè)和45個(gè)與細(xì)胞質(zhì)相關(guān)的蛋白被上調(diào)[15]，已有研究證實(shí)，大部分此類蛋白質(zhì)都與細(xì)菌耐受膽鹽脅迫環(huán)境有關(guān)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的手段，對(duì)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG在0.2%的膽鹽中的耐受性進(jìn)行研究，結(jié)果其轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的基因表達(dá)均會(huì)有差異[16]。

2.3 冷脅迫

乳酸菌作為發(fā)酵劑在加工和貯存過(guò)程中一般處于低溫環(huán)境中。低溫環(huán)境不僅影響細(xì)胞活性，損傷細(xì)胞膜的形態(tài)及其流動(dòng)性，而且還影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。生物體自身為了克服此種影響會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量蛋白，稱為冷誘導(dǎo)蛋白 (cold-induced proteins，CIPS)，不同乳酸菌個(gè)體在冷脅迫下誘導(dǎo)形成的CIPS的數(shù)量不同，如乳桿菌、嗜熱鏈球菌可分別誘導(dǎo)產(chǎn)生22和24種蛋白質(zhì)。其中分子量大約7.5kDa的冷誘導(dǎo)蛋白被稱為冷激蛋白(cold-shock proteins，Csp)。 冷激蛋白的數(shù)量會(huì)因菌種的不同而不同，乳酸鏈球菌乳酸亞種IL1403和植物乳桿菌C3.8只有2個(gè)Csp基因，植物乳桿菌NC8有3個(gè)Csp基因，而乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363中卻含有7個(gè)Csp基因(CspA-CspG)[17-18]。 Kim等研究發(fā)現(xiàn)Csp的誘導(dǎo)機(jī)制非常復(fù)雜，但似乎都是控制在轉(zhuǎn)錄后水平[19]。研究表明，很多乳酸菌對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)性與其之前所生存的環(huán)境具有密切的關(guān)系，Wang等對(duì)嗜酸乳桿菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)一個(gè)溫和的低溫過(guò)渡環(huán)境(28℃)能夠提高細(xì)胞對(duì)寒冷環(huán)境的適應(yīng)能力[20]。還有研究表明菌體先在26℃環(huán)境中生存8小時(shí)會(huì)到達(dá)其最適的耐受寒冷的能力，在德氏乳桿菌保加利亞亞種中發(fā)現(xiàn)菌株先受到酸脅迫(pH5.25中30min)，也可提高其對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力[21]。乳酸菌在不同溫度環(huán)境中其蛋白表達(dá)也存在差異。

2.4 高溫脅迫

眾所周知，菌體細(xì)胞均有最適生長(zhǎng)溫度，溫度太高時(shí)會(huì)引起蛋白降解，進(jìn)而引起核糖體和RNA等一些大分子物質(zhì)的不穩(wěn)定性，并且細(xì)胞膜流動(dòng)性也會(huì)發(fā)生改變。熱激反應(yīng)的特征是誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列伴侶蛋白和蛋白酶，稱為熱激蛋白(Heat Shock Protein，HSP)。 在乳酸菌中，熱應(yīng)激條件下所誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱激蛋白數(shù)量是不同的，如糞腸球菌中34個(gè)、乳酸乳桿菌17個(gè)、變異鏈球菌40個(gè)，而在此40個(gè)中，只有6個(gè)是上調(diào)的。Whitake和Auffary等利用2D-PAGE法對(duì)熱激環(huán)境中的乳酸乳球菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在該脅迫環(huán)境下，乳酸乳球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生了熱激蛋白 (DnaK、GroEL和GroES)[22-23]。同樣，利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)在熱激環(huán)境下，副干酪乳桿菌NFBC 338中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生GroEL。HSP的表達(dá)的動(dòng)力學(xué)會(huì)隨著熱激反應(yīng)發(fā)生變化，例如菌體剛進(jìn)入高溫環(huán)境就會(huì)產(chǎn)生熱激蛋白DnaK和GroEL，而其他的HSP是在進(jìn)入高溫環(huán)境一段時(shí)間后才會(huì)產(chǎn)生。

在高溫環(huán)境下，乳酸乳桿菌和副干酪乳桿菌中編碼GroESL的基因過(guò)表達(dá)，但仍不能夠消除高溫環(huán)境對(duì)菌體的影響，這是因?yàn)榫w內(nèi)其它蛋白質(zhì)沒(méi)有對(duì)此環(huán)境做出適應(yīng)性反應(yīng)。德氏乳桿菌保加利亞亞種在65℃熱激10 min后，通過(guò)HSP的合成會(huì)使得菌株的死亡率降低，但如果早期的HSP合成受阻，則菌體的死亡率會(huì)大大增加[24]。

在嗜酸乳桿菌中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯誘導(dǎo)某些HSP產(chǎn)生。其中，對(duì)mRNA的分析主要集中在ftsH基因和CIRCE調(diào)控基因(DnaJ，GroESL和HrcA-GrpE-DnaK)上。研究發(fā)現(xiàn)，熱激10～15 min后，CIRCE基因的表達(dá)會(huì)提高10-100倍，而熱激20 min時(shí)，該基因的表達(dá)受到了抑制[25]。與此同時(shí)，乳酸乳桿菌還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)ClpP基因和四個(gè)Clp-ATPase基因(ClpB,ClpC，ClpE和ClpX)，在高溫環(huán)境中，這些基因均會(huì)做出相應(yīng)的調(diào)控，從而保護(hù)菌體免受高溫?fù)p傷。

2.5 氧脅迫

乳酸菌大部分為兼性厭氧菌，盡管氧氣對(duì)菌體細(xì)胞本身沒(méi)有損傷作用，但是在其代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)(過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)以及過(guò)氧化自由基(O.))能引起脂類、蛋白質(zhì)及DNA等的損傷，進(jìn)而使菌體細(xì)胞受損[26]。氧脅迫由特定的轉(zhuǎn)錄因子控制，當(dāng)ROS的濃度超過(guò)正常水平產(chǎn)生氧脅迫時(shí)，便可激活菌體的抵御機(jī)制，從而使菌體免受損傷。Mostertz等利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)枯草芽孢桿菌的氧脅迫進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)氧化氫處理后，55種蛋白的合成上調(diào)，150種蛋白的合成下降。而經(jīng)過(guò)超氧陰離子處理后，有60多種蛋白質(zhì)被過(guò)量的表達(dá)，而200多種的表達(dá)受到了限制。這說(shuō)明氧脅迫對(duì)于菌體蛋白質(zhì)合成代謝具有很大的影響[27]。

Arena等對(duì)嗜熱鏈球菌在氧脅迫環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)行研究，利用蛋白質(zhì)組學(xué)與雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)相結(jié)合的方法，對(duì)各種條件下所產(chǎn)生的氧脅迫的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2會(huì)促使大量應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生，其中包括可補(bǔ)償由于氧化應(yīng)激而引起缺失的特定蛋白質(zhì)，例如，NADH氧化酶、Mn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶以及Fe-S組件蛋白Suf B和Suf C，而與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)卻下調(diào)[28]。

2.6 營(yíng)養(yǎng)脅迫

細(xì)菌在繁殖的過(guò)程中，如果不能及時(shí)補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，便會(huì)導(dǎo)致菌體進(jìn)入饑餓狀態(tài)，引發(fā)營(yíng)養(yǎng)脅迫現(xiàn)象。值得關(guān)注的是，有時(shí)由于其它脅迫也會(huì)間接的使菌體出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況。例如，在酸脅迫時(shí)，一些轉(zhuǎn)運(yùn)子的活性降低，致使物質(zhì)的利用率降低，這對(duì)菌體本身會(huì)產(chǎn)生不利影響。導(dǎo)致乳酸菌產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)脅迫現(xiàn)象的主要原因有以下3種：(1)碳源脅迫，會(huì)使能量耗盡；(2)磷酸鹽脅迫，會(huì)使能量以及RNA和DNA的合成受阻；(3)氮源脅迫，主要影響蛋白質(zhì)的合成。

乳酸菌需要在穩(wěn)定期維持較高的代謝能力。Kunji等指出在碳源脅迫時(shí)，乳球菌的存活能力與其糖酵解的能力相關(guān)。同樣，也有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝在乳酸乳球菌應(yīng)答碳源脅迫時(shí)起著很重要的作用，這說(shuō)明該脅迫環(huán)境下代謝的調(diào)節(jié)極為重要。利用雙向凝膠電泳對(duì)碳源脅迫下的乳酸乳桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該脅迫環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生14個(gè)蛋白質(zhì)。并且這些蛋白質(zhì)多數(shù)是與碳水化合物及氨基酸的代謝有關(guān)[29-31]在乳酸乳桿菌中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌株處于氨基酸缺乏時(shí)，由鳥嘌呤合成(RelA)所調(diào)節(jié)的核苷酸代謝會(huì)做出反應(yīng)，經(jīng)研究，RelA是調(diào)節(jié)了控制蛋白水解通路的CodY基因[32]。

目前發(fā)現(xiàn)，乳酸乳桿菌中碳源缺乏會(huì)引起其它條件的脅迫，包括熱脅迫、氧脅迫、酸脅迫、滲透壓脅迫等。在對(duì)保加利亞乳桿菌研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳糖缺乏時(shí)，菌株對(duì)于熱脅迫、酸脅迫和膽鹽脅迫的抵抗能力增強(qiáng)。

大多數(shù)的乳酸菌處于脅迫環(huán)境還會(huì)產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用現(xiàn)象，Wall等指出，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)在高膽鹽環(huán)境中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生某些蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)菌體具有一定的保護(hù)作用[33]。De Anqelis M在對(duì)舊金山乳桿菌(Lactobacillus sanfranciscensis)CB1的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌體處于較低pH環(huán)境時(shí)，與高溫脅迫相關(guān)的分子伴侶 (DnaJ,DnaK,GroES和GrpE)也會(huì)被誘導(dǎo)，但只有GrpE水平上調(diào)[34]，而這些酶均參與復(fù)雜碳水化合物的代謝，這說(shuō)明在酸脅迫條件下，菌體的代謝會(huì)發(fā)生改變。

3 結(jié)束語(yǔ)

對(duì)乳酸菌在各種脅迫環(huán)境下的分子機(jī)理進(jìn)行研究，不僅可以了解其應(yīng)答機(jī)制，而且更重要的是可以挖掘出優(yōu)良的益生菌菌株，開發(fā)新的益生菌產(chǎn)品。盡管人們對(duì)乳酸菌脅迫環(huán)境中的抵御機(jī)制的研究取得了進(jìn)展，但是仍然有些問(wèn)題未得到解決，包括各種脅迫環(huán)境的交叉保護(hù)現(xiàn)象等，這些內(nèi)在的聯(lián)系必須采用其它手段(如：代謝工程技術(shù)等)進(jìn)行深入細(xì)致的研究。相信隨著基因測(cè)序技術(shù)的成熟以及基因組數(shù)據(jù)的大量積累，結(jié)合分子生物學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)對(duì)乳酸菌的信息表達(dá)進(jìn)行再挖掘，定會(huì)為其更為充分的利用提供寶貴資料。

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