何嘉玲,劉靜,王天奇,暴國,張長勇,孫希貞,孫德明

(國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所, 北京 100081)

斑馬魚(Daniorerio)是目前生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)用魚，然而作為新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，尚缺乏對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究。本文將從斑馬魚的研究歷史及特性出發(fā)，對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程、現(xiàn)狀以及存在的問題展開綜述，以期為斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源標(biāo)準(zhǔn)化的建立提供有益的參考。

1 斑馬魚的研究歷史與特性

斑馬魚又名藍(lán)條魚、花條魚、印度魚，原產(chǎn)自印度東部、巴基斯坦、緬甸、孟加拉國等地,屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)。因身上具有像斑馬一樣的條紋而得名。

20 世紀(jì)70 年代, 著名遺傳學(xué)家George Streisinger建立了斑馬魚的純系[1-2]，并在《Nature》上發(fā)表了關(guān)于斑馬魚人工雌核發(fā)育的研究論文[1]，從此人們開始關(guān)注這一新興的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[3-9]。為取得資源和信息的共享，在Monte Westerfield 領(lǐng)導(dǎo)下, 俄勒岡大學(xué)先后建成了斑馬魚信息網(wǎng)絡(luò)—Zebrafish Information Network, ZFIN (1998)[10]和斑馬魚國際資源中心—Zebrafish International Resource Center，ZIRC (2004)，隨后世界各地也分別建立了6個(gè)斑馬魚資源中心。

1998年，清華大學(xué)建立了國內(nèi)第一個(gè)以斑馬魚為模式動(dòng)物的發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，開啟了斑馬魚在我國的研究。目前我國已有250 個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)室利用斑馬魚開展多學(xué)科領(lǐng)域的研究。2012年10月，在科技部“發(fā)育與生殖重大科學(xué)研究計(jì)劃”項(xiàng)目的資助下,我國的“國家斑馬魚資源中心，China Zebrafish Resource Center, CZRC”在中國科學(xué)院水生生物研究所正式掛牌成立,截止2013 年2月, 中心已通過各種渠道引進(jìn)和自建60 多個(gè)斑馬魚轉(zhuǎn)基因和突變品系[11]。

斑馬魚之所以具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的潛質(zhì)并得到廣泛應(yīng)用，是由其獨(dú)特的優(yōu)勢決定的，(1)斑馬魚成魚個(gè)體小，易于大規(guī)模飼養(yǎng)；(2)生長快、性成熟期短、產(chǎn)卵周期短、產(chǎn)卵量大，是經(jīng)濟(jì)、方便的研究材料；(3)胚胎體外發(fā)育，早期胚胎完全透明，易于觀察和操作；(4)在斑馬魚上已經(jīng)建立較完善的胚胎和遺傳學(xué)操作技術(shù)；(5)基因組測序完成，與爪蟾、果蠅等低等動(dòng)物相比,斑馬魚的基因圖譜基本清晰且與人類具有87%的相似度；(6)斑馬魚的心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺系統(tǒng)與人類有許多共同特點(diǎn)，為開展比較醫(yī)學(xué)研究和建立人類疾病動(dòng)物模型提供重要基礎(chǔ)；(7)品系資源豐富，對(duì)開展各領(lǐng)域科學(xué)研究極為有利。

2 斑馬魚質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的研究

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)范化研究是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)科及其行業(yè)的重要特點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物區(qū)別于其他類動(dòng)物的本質(zhì)特征[12]。斑馬魚的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化體系主要包括對(duì)斑馬魚微生物學(xué)與寄生蟲學(xué)、遺傳學(xué)質(zhì)量、營養(yǎng)以及環(huán)境條件等方面的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范。

2.1 微生物與寄生蟲控制

疾病的控制和健康狀態(tài)的維持是實(shí)驗(yàn)用魚標(biāo)準(zhǔn)化管理的一個(gè)首要環(huán)節(jié)。斑馬魚易感的病毒尚未見報(bào)道，在人工飼養(yǎng)條件下斑馬魚的質(zhì)量控制的對(duì)象主要包括細(xì)菌和寄生蟲的控制[13]。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種類主要包括: 分支桿菌(Mycobacterium)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。寄生蟲主要包括: 微孢子蟲(Pseudolomaneurophilia)，卵圓鞭毛蟲(Piscinoodiniumpillulare)和多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)等[14]。微生物與寄生蟲的感染會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的發(fā)育遲緩，繁殖力下降，甚至死亡。然而在許多無臨床癥狀的隱性感染中[15]，科學(xué)家通過高通量深測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)微生物感染往往引起斑馬魚轉(zhuǎn)錄組水平的顯著變化，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性、規(guī)律性、重復(fù)性。類似的研究表明感染還會(huì)引起斑馬魚生理生化指標(biāo)，免疫力指標(biāo)，組織學(xué)和遺傳學(xué)的改變，甚至在實(shí)驗(yàn)刺激下使感染顯性化，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚得病、死亡，迫使實(shí)驗(yàn)終止[16-18]。

鑒于病原體對(duì)斑馬魚的危害，各國開始致力于無菌斑馬魚和無特定病原體(specific pathogen free, SPF)斑馬魚的研究。2004 年, 美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員首次培育出無菌斑馬魚, 相關(guān)研究成果發(fā)表在《美國科學(xué)院院報(bào)》網(wǎng)絡(luò)版上[19]。2014年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所也公布了專利— “無菌斑馬魚的生產(chǎn)方法”(專利號(hào)：2013100962469)[20]。2011年，Kent等[21]成功培育了無微孢子蟲的SPF斑馬魚，2010年10月，第五屆人類疾病的水生動(dòng)物模型會(huì)議組織了題為“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康與疾病管理(Animal Health and Disease Management in Research Animals)”的研討會(huì)，專門討論了水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是斑馬魚的病原控制策略[22]。說明斑馬魚等實(shí)驗(yàn)魚類的病原控制問題已經(jīng)引起了國際科研工作者的廣泛關(guān)注。

2.2 遺傳質(zhì)量控制

斑馬魚的遺傳質(zhì)量控制和遺傳檢測，是標(biāo)準(zhǔn)化的重要內(nèi)容之一。

國內(nèi)外學(xué)者已在逐步開展斑馬魚遺傳學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化研究，并對(duì)一些有應(yīng)用價(jià)值的小型魚類進(jìn)行了純化培育工作，如斑馬魚、虹鳉(Poeciliareticulatus)、青鳉(Oryziaslatipes)、新月魚(Xiphophorusmaculatus)、劍尾魚(Xiphophorushelleri)都有近交超過20代的品系，這些品系已經(jīng)有較高的遺傳均一性。目前，斑馬魚自然野生品系有約20 個(gè)。研究中常用的斑馬魚野生型品系純系主要為Tuebingen 品系(簡稱TU, 起源于Streisinger Lab)、AB品系、WIK 品系(起源于Haffter Lab) , 其中斑馬魚基因組計(jì)劃所用品系為Tuebingen 品系。經(jīng)過各國實(shí)驗(yàn)室30多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展,現(xiàn)保存有3000 多個(gè)突變品系和100 多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系。

2.3 飼養(yǎng)管理

魚類終身生活在水中并在水中攝食和排泄，有效的標(biāo)準(zhǔn)化水環(huán)境動(dòng)態(tài)管理和飼料的營養(yǎng)學(xué)控制是做好斑馬魚飼養(yǎng)管理的關(guān)鍵。加拿大動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)在《用于研究、技術(shù)和實(shí)驗(yàn)的魚類的使用和管理指南》中對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚水環(huán)境做了較為全面的規(guī)定[23]。我國的王天奇[24]等也對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚類水的供給、水質(zhì)和水環(huán)境的物理指標(biāo)進(jìn)行了分析,為斑馬魚水環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化研究提供了必要的資料。

由于目前對(duì)斑馬魚生長各階段的營養(yǎng)需求缺乏清晰準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，斑馬魚的配合飼料研發(fā)進(jìn)展緩慢[25]。2009年，祝梅香等[26]綜述了多種斑馬魚飼料的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)活性餌料在提高斑馬魚的生長率和存活率方面明顯優(yōu)于配合飼料。然而活性餌料攜帶的病原體也對(duì)斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖提出了挑戰(zhàn)。2012年，杭州環(huán)特科技有限公司的張勇等研發(fā)了“一種斑馬魚魚苗開口飼料”(專利號(hào)：201010514931)[27]。專利提供了一種斑馬魚魚苗開口飼料的配方，為斑馬魚幼魚養(yǎng)殖的飼料選擇提供了重要的技術(shù)參考。

2.4 實(shí)驗(yàn)用魚北京市地方標(biāo)準(zhǔn)

2007年，國家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所聯(lián)合中國食品藥品檢定研究院、中國科學(xué)院水生生物研究所和北京大學(xué)等單位，開展了實(shí)驗(yàn)用魚地方標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)研究。2013年，第一部實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)(DB11/T 1053-2013)由北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局正式頒布，并于2014年4月1日開始實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容包括：“實(shí)驗(yàn)用魚——微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測[15，28]; 實(shí)驗(yàn)用魚——寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測; 實(shí)驗(yàn)用魚——遺傳質(zhì)量控制[29]; 實(shí)驗(yàn)用魚——配合飼料技術(shù)要求;實(shí)驗(yàn)用魚——環(huán)境條件; 實(shí)驗(yàn)用魚——病理診斷規(guī)范”六個(gè)部分。該標(biāo)準(zhǔn)是國內(nèi)外首部實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

3 問題及建議

我國從“九五”計(jì)劃開始就已經(jīng)將魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的開發(fā)與應(yīng)用研究作為重點(diǎn)資助項(xiàng)目列入國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展計(jì)劃。將近二十年過去了，魚類作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源其標(biāo)準(zhǔn)化還有一系列問題亟待解決。

3.1 存在問題

3.1.1 斑馬魚的生物凈化問題

斑馬魚屬于熱帶魚類, 適于斑馬魚生長繁育的水環(huán)境, 也適于病原微生物和寄生蟲的迅速繁殖。雖然一些斑馬魚的品系經(jīng)過純化培養(yǎng)已經(jīng)有較高的遺傳均一性，但在微生物、寄生蟲及常見疾病控制、生產(chǎn)繁育、應(yīng)用、水環(huán)境條件等方面與真正法定意義的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還有本質(zhì)的差距。目前，斑馬魚的病原學(xué)診斷主要參考其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病原監(jiān)測操作規(guī)程，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的快速準(zhǔn)確的病原檢測方法，標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)體系，疾病防控與診治的技術(shù)規(guī)范。

3.1.2 飼養(yǎng)管理問題

斑馬魚養(yǎng)殖的外部環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)主要參照國標(biāo)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施 GB14925-2010》對(duì)于哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通環(huán)境級(jí)別的要求制定。但因斑馬魚的生活環(huán)境為水體，且生活環(huán)境所需的晝夜明暗交替時(shí)間與哺乳動(dòng)物不同，故無法完全參照哺乳動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)。目前國內(nèi)外尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)用斑馬魚生產(chǎn)機(jī)構(gòu)，斑馬魚的養(yǎng)殖普遍存在來源混雜，遺傳背景不清；微生物和寄生蟲以及相關(guān)疾病未加控制；養(yǎng)殖環(huán)境不規(guī)范；飼料營養(yǎng)水平不均衡等問題。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)的推廣問題

日前，實(shí)驗(yàn)用魚北京市地方標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)頒布，但與之配套的標(biāo)準(zhǔn)追蹤體系尚未建全，在很大程度上影響了標(biāo)準(zhǔn)的推廣和示范。

3.2 為進(jìn)一步推動(dòng)我國實(shí)驗(yàn)用斑馬魚質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，建議開展以下工作：

3.2.1 加強(qiáng)斑馬魚病原體的控制

加強(qiáng)日常健康狀況的監(jiān)測； 建立魚病原體檢測和評(píng)價(jià)體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)用斑馬魚生產(chǎn)和使用涉及的相關(guān)產(chǎn)品包括哨兵魚、水環(huán)境、水族箱及主要器具的微生物、寄生蟲感染水平進(jìn)行檢測評(píng)估；對(duì)國內(nèi)外及科研機(jī)構(gòu)間流通的斑馬魚實(shí)施嚴(yán)格的檢疫；建立病原體感染后快速有效處理的技術(shù)規(guī)范；積極提升實(shí)驗(yàn)室的自檢能力，利用斑馬魚網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)及時(shí)報(bào)道新發(fā)現(xiàn)的隱性感染，豐富斑馬魚生物凈化和健康研究的資料；研究制定實(shí)驗(yàn)用斑馬魚生產(chǎn)、飼養(yǎng)、運(yùn)輸、管理和使用的技術(shù)規(guī)范體系，并向醫(yī)藥研發(fā)和相關(guān)高校機(jī)構(gòu)以及企業(yè)推廣，形成產(chǎn)學(xué)研結(jié)合升級(jí)模式。

3.2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)化斑馬魚繁育示范基地

在生物凈化基礎(chǔ)上，建立國家級(jí)能滿足實(shí)驗(yàn)需求的實(shí)驗(yàn)用斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)化種子繁育示范基地。在此基礎(chǔ)上建立實(shí)驗(yàn)用魚類質(zhì)量的國家標(biāo)準(zhǔn)體系和飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范。標(biāo)準(zhǔn)的使用過程中，增加標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)培訓(xùn)，同時(shí)加大力度培養(yǎng)從事實(shí)驗(yàn)用斑馬魚開發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，推動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化斑馬魚產(chǎn)業(yè)化基地的形成。

3.2.3 建立實(shí)驗(yàn)用斑馬魚質(zhì)量追蹤體系

以基地為中心，加大檢測技術(shù)和質(zhì)量控制方面研究的基礎(chǔ)性投入和應(yīng)用性投入，建立急需的標(biāo)準(zhǔn)體系和質(zhì)量追蹤評(píng)價(jià)體系；建立健全監(jiān)測機(jī)構(gòu)和檢測的SOP；加大對(duì)斑馬魚標(biāo)準(zhǔn)化微生物與寄生蟲檢測技術(shù)和試劑研發(fā)，形成標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法；開展快速篩查檢測新方法和新技術(shù)的研發(fā)，為我國斑馬魚現(xiàn)場執(zhí)法和質(zhì)量管理提供必要的技術(shù)支持等。同時(shí)全面收集標(biāo)準(zhǔn)在使用過程中發(fā)現(xiàn)的問題，為標(biāo)準(zhǔn)的修訂和完善做技術(shù)準(zhǔn)備。

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